耐亞胺培南銅綠假單胞菌金屬β－內酰胺酶的檢測及耐藥性分析

何力志，黃露萍，李志芳，彭愛紅

(湖南省第二人民醫院，湖南長沙410007)

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)對亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥機制主要包括產碳青霉烯酶、外膜孔蛋白OprD缺失或表達下降、主動外排泵系統表達增高等。目前，在PA中發現的碳青霉烯酶主要是金屬β-內酰胺酶(metallo-betal-lactamase，MBL)。PA中編碼 MBL的基因大多由質粒攜帶，且定位于整合子上。雖然目前報道產MBL的PA數量仍較少，但由于整合子的傳播特性使得 MBL的數量正在增加，隨時可能引起醫院感染的爆發和流行［1］。因此，加強對PA耐藥性的檢測和監控，分析其藥物敏感性，指導臨床合理用藥，已成為防止耐藥產生與蔓延并進行有效醫院感染控制的一個重要環節。本研究對湖南省第二人民醫院耐亞胺培南PA進行了MBL的檢測及耐藥性分析。

材料和方法

一、材料

1.菌株的收集和鑒定 全部460株PA分離自湖南省第二人民醫院2009至2011年臨床標本(排除同一患者同一部位的重復菌株)，其中痰液182株、咽拭子133株、創面分泌物69株、尿液60株、血液及引流液16株。標準菌株為PA(ATCC 27853)。

2.主要試劑與儀器 聚合酶鏈反應(PCR)引物合成及試劑購自上海生物工程技術服務有限公司，Microscan walkAway-40全自動微生物鑒定系統為美國德靈公司產品。水解酪蛋白胨(MH)瓊脂、亞胺培南等藥物敏感性紙片均為英國OXIOD公司產品。

二、方法

1.細菌鑒定與藥物敏感性試驗 所有分離菌株的培養鑒定嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》進行，采用德靈Microscan walkAway-40全自動微生物鑒定系統對所有收集的菌株進行菌種鑒定及藥物敏感性試驗，藥物折點采用美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2009年標準。

2.組合紙片法檢測MBL表型 具體操作參照文獻［2］，直徑增大≥6 mm 為產 MBL株［3］。

3.PCR檢測MBL基因型別 參照文獻［4-6］設計引物 IMP-1 、IMP-2、SPM-1、GIM-1，然后進行PCR擴增［7］，PCR鑒定后送生工生物上海有限公司測序，結果在GenBank網上比對。

4.耐藥性比較 比較2009至2011年不同年份耐亞胺培南PA產生比例，比較產與不產MBL耐亞胺培南PA耐藥譜差異，并對MBL不同基因型別菌株耐藥特征進行分析。

三、統計學方法

采用SAS 8.0軟件進行統計分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、2009至2011年PA亞胺培南耐藥結果

460株PA中亞胺培南耐藥菌株173株，占37.6%。2009至2011年耐亞胺培南PA比例分別為35.0%(49/140)、37.3%(57/153)、40.2%(67/167)，有逐年增高趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05)。

二、MBL表型

采用組合紙片法檢測MBL表型，173株耐亞胺培南PA中共檢出MBL表型陽性PA 28株，占16.2%(28/173)。

三、MBL基因型別

28株MBL表型陽性PA共擴增IMP-1型陽性19株，VIM-2型陽性2株。見圖1。

圖1 PCR檢測結果

四、測序結果

隨機各選取1例IMP-1和 VIM-2引物擴增陽性的菌株送生工生物(上海)有限公司進行測序，測序結果直接在GenBank中進行序列對比分析，分別與 IMP-1 GenBank注冊號AY1686359和VIM-2 GenBank注冊號AF191564相同。

五、產與不產MBL耐亞胺培南PA耐藥譜的比較

173株耐亞胺培南PA，其中產 MBL菌株21株，不產MBL菌株152株。產MBL菌株對美羅培南耐藥率為95.2%，高于不產MBL菌株(73.7%，P＜0.05);產 MBL菌株對其他抗菌藥物的耐藥率均高于不產MBL菌株，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 產MBL菌株與不產MBL菌株對不同藥物的耐藥率［株(%)］

六、MBL不同基因型別菌株的耐藥特征

產IMP-1型與VIM-2型MBL菌株引起耐藥的共同特點是能水解大多數β-內酰胺類抗菌藥物:哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢哌酮-舒巴坦，對阿米卡星以外多種抗菌藥物耐藥。19株IMP-1型菌株中，3株對所測抗菌藥物全部耐藥，6株為同一耐藥模式，對環丙沙星、頭孢他啶、頭孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大霉素耐藥，2株VIM-2型菌株全部對頭孢他啶、頭孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大霉素耐藥。

討 論

近年來，PA的臨床感染逐漸增多，其對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥菌株亦有逐年上升的趨勢。王輝等［8］報道，2003至2004年中國10所教學醫院PA對亞胺培南的耐藥率為22% ～24%，2008年CHINET細菌耐藥監測數據顯示，PA對亞胺培南和美羅培南耐藥率分別為30.5%、24.5%［9］。本研究臨床分離的PA對亞胺培南耐藥率從2009年的35.0%上升到2011年的40.2%。

產MBL是PA對亞胺培南耐藥的重要機制之一，其基因位于細菌染色體或質粒上，可通過基因盒在不同細菌間水平傳播耐藥性。本研究173株耐亞胺培南 PA中產 MBL菌株 21株，非產MBL菌株152株。比較產與不產MBL耐亞胺培南PA耐藥譜發現，產MBL PA對大部分抗菌藥物耐藥率要高于不產MBL PA，但除美羅培南外，差異無統計學意義。究其原因可能是PA的耐藥機制極為復雜，往往不是由單一因素所造成，通常是幾種機制共同作用的結果。碳青霉烯酶是導致其對亞胺培南和美羅培南高水平耐藥［最低抑菌濃度(MIC)≥32 mg/L］的主要機制［10］。

本研究顯示，PA產MBL基因型別不同，耐藥性也不同。19株IMP-1型菌株中，3株對所測抗菌藥物全部耐藥，6株為同一耐藥模式，2株VIM-2型菌株全部對頭孢他啶、頭孢吡肟 、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦、美羅培南、慶大霉素耐藥。IMP-1型和VIM-2型菌株，其耐藥模式存在一定程度差異，可能與該克隆株在不同感染個體所受到的抗菌藥物選擇壓力的差異有關，使其能自行啟動某些耐藥機制以適應其生存的環境。這提示，臨床上應加強病原學檢查，根據藥物敏感性結果選擇藥物，以達到最佳抗菌效果。本研究IMP-1型菌株有6株為同一耐藥模式，是否為同一克隆株還需通過腸桿菌將基因間重復序列(ERIC)PCR電泳進一步證實，但加強對產酶株的檢測和監控，對防止耐藥性的傳播和流行十分必要。

［1］郭小慧.銅綠假單胞菌耐藥機制的最新研究進展［J］.國際檢驗醫學雜志，2011，32(9):968-971.

［2］陶 晶，張俊麗，瞿婷婷，等.銅綠假單胞菌金屬β-內酰胺酶分布及產金屬酶檢測方法比較［J］.檢驗醫學，2009，24(2):145-148.

［3］Bergès L，Rodriguez-Villalobos H，Deplano A，et al.Prospective evaluation of imipenem/EDTA combined disc and Etest for detection of metallo-beta-lactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59(4):812-813.

［4］徐元宏，沈繼錄，楊伯俠，等.產金屬酶合并外膜蛋白缺失的銅綠假單胞菌的檢測［J］.中華醫院感染學雜志，2005，15(10):1085-1089.

［5］Gales AC，Menezes LC，Silbert S，et al.Dissemination in distinct Brazilian regions of an epidemic carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing SPM metallo-beta-lactamase ［J］.J Antimicrob Chemother，2003，52(4):699-702.

［6］Castanheira M，Toleman MA，Jones RN，et al.Molecular characterization of a beta-lactamase gene，blaGIM-1，encoding a new subclass of metallo-betalactamase［J］.Antimicrob Agents Chemother，2004，48(12):4654-4661.

［7］潘婉儀，黃憲章，楊 潔，等.廣州地區產金屬β-內酰胺酶銅綠假單胞菌的流行病學研究［J］.南方醫科大學學報，2010，30(8):1893-1895.

［8］王 輝，陳民鈞，倪語星，等.2003-2004年中國十家教學醫院革蘭陰性桿菌的耐藥分析［J］.中華檢驗醫學雜志，2005，28(12):1295-1303.

［9］汪 復，朱德妹，胡付品，等.2008年中國CHINET細菌耐藥性監測［J］.中國感染與化療雜志，2009，9(5):321-329.

［10］Kucisec-Tepes N.Pseudomonas aeruginosa-a significant hospital pathogen and resistance to carbapenem［J］.Acta Med Croatica，2004，58(4):313-321.