雌性肥胖大鼠皮下脂肪與內臟脂肪Vaspin mRNA的變化

天津市兒童醫院內分泌科 （天津300074） 商躍云 黃 樂 孫桂香 呂 玲 趙 彥

脂肪組織不僅是儲存和釋放能量的場所，而且是重要的內分泌器官，可分泌多種脂肪細胞因子［1］。內臟脂肪組織特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑（Visceral adipose tissue－erived serine protease inhibitor，Vaspin）是由脂肪組織分泌的脂肪細胞因子，有研究證實Vaspin水平與營養狀態、性別等有關［2］，高脂飲食誘發的雄性肥胖大鼠血與內臟脂肪組織（睪周脂肪組織）Vaspin改變與胰島素敏感性減退有關［3］，但雌性大鼠內臟脂肪組織與皮下脂肪組織（Subcutaneous adipose tissues，SAT）Vaspin改變的研究較少。本文旨在通過高脂飼料喂養雌性大鼠制造肥胖大鼠模型，對比血糖、胰島素、血脂及腎周脂肪組織（Perirenal adipose tissue，PAT）與SAT Vaspin的改變，為進一步探討其在糖脂代謝和能量平衡調節中的作用及機制提供基礎。

材料與方法

1 實驗材料

1．1 主要實驗儀器：紫外分光光度計：Smart SpecTM plus spectrophotometer，Bio－Rad，USA；電泳儀：PowerPac Basic，Bio－Rad，USA；凝膠成像系統：ChemiDocXRS，Bio－Rad USA；Real－time PCR 儀7500型：Applied Biosystems，USA。

1．2 主要試劑：Trizol：Invitrogen Technoloyies Ins，USA（批號：1158824）；DEPC：天津鼎天生物技術有限公司，Sigma分裝進口（批號：D5758）；乙二胺四乙酸（EDTA）：Sigma公司（批號：083K5420）；dNTP：Fermentas（批號：9001）；Taq酶：Fermentas（批號：1005）；Oligo d（T）18：大連寶生物工程有限公司（批號：CT201C）；Ribonuclease inhibitor：大連寶生物工程有限公司（批號：CCA3901A）；DL2000DNA Marker：大連寶生物工程有限公司（批號：CC1502）；逆轉錄酶MMLV：Promega（批號：19847105）；引物合成：北京奧科生物工程公司；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）：Roche，Germany（批號：04 913 914 001）；普通飼料（大麥粉20%，玉米粉15%，花生粉10%，豆粉20%，魚粉10%，骨粉5%，酵母粉1%，麥麩15%，食鹽2%，混合礦物鹽1．5%，復合維生素0．5%）與高脂飼料（含普通飼料65．8%，添加豬油0．2%，蛋黃粉10%，蔗糖8%，酵母粉3%，混合礦物鹽1．5%，膽固醇1%，豬膽鹽0．2%，復合維生素0．5%）均由天津醫科大學實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2．1 實驗動物的分組與模型建立：取SPF級斷乳雌性SD大鼠16只（購自天津市放射研究所動物實驗中心），隨機分成普通飲食組（A組）與高脂飲食組（B組），每組8只，分別給予普通飼料與高脂飼料連續喂養4周。

2．2 體格測量指標：實驗開始時及連續喂養4周后均于禁食、水12h后測量體重（Weight，W）、體長（Height，H）及腹圍（Abdominal circumference，AC）。內眥靜脈取血后斷頭處死，分離SAT與PAT迅速放入液氮，然后置于－80℃冰箱中保存備用。

2．3 空腹血糖、胰島素及血脂測定：測量空腹血糖（FPG），胰島素（FINS）、血總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）與高密度脂蛋白（HDL）。FPG采取葡萄糖氧化酶法測定，FINS采用放射免疫法測定，血脂測定采用酶法。

2．4 SAT與PAT Vaspin mRNA水平的測定：采用實時定量聚合酶鏈反應（Real time polymerase chain reaction，Real－time PCR）法，主要操作步驟如下：采用Trizol法分別提取脂肪組織總RNA，紫外分光光度法對其定量，吸光度260／280比值判定純度，瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測完整性。經逆轉錄合成cDNA后進行Real－time PCR擴增。內參照肌動蛋白（β－actin）與目的片段Vaspin的引物應用軟件Gene Runner、并根據GenBank所發布的目的基因序列自行設計，同時經NCBI BLAST檢索無顯著同源性。具體引物序列和擴增片段長度，見表1。

表1 Real－time PCR 引物序列

Real－time PCR反應體系參照SYBR Green Real time PCR Master Mix試劑盒說明書。PCR循環參數：95℃預變性5min，95℃變性15s，60℃退火15s，72℃延伸34s，進行40個循環。溫度變化速度為3℃／s，在每個循環延伸階段檢測熒光信號，進行實時監控，最后進入解鏈階段，繪制產物的融解曲線，以了解樣品擴增的特異性，保證測定結果的準確可靠。數據的收集由ABI 7500定量PCR儀自帶軟件完成。每管樣品重復測定4次。

3 統計學方法 采用SPSS13．0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 實驗開始時兩組大鼠體格測量參數比較：兩組大鼠 W、H及AC差異均無統計學意義（P＞0．05），具有可比性，見表2。

表2 實驗開始時兩組大鼠體格測量參數比較（±s，n＝8）

表2 實驗開始時兩組大鼠體格測量參數比較（±s，n＝8）

注：與A組比較，＊P＞0．05

組別 W（g） H（cm） AC（cm）A組77．88±10．67 11．13±0．88 7．17±0．86 B組 77．38±11．21＊ 10．94±0．94＊ 7．23±0．80＊

2 喂養4周后兩組大鼠體格測量參數比較：兩組大鼠 W、H及AC差異均有統計學意義（P＜0．05），且B組大鼠體重均超過A組大鼠平均體重20%，實驗肥胖大鼠造模成功，見表3。

表3 喂養4周后兩組大鼠體格測量參數比較 （±s，n＝8）

表3 喂養4周后兩組大鼠體格測量參數比較 （±s，n＝8）

注：與 A組比較，＊P＜0．05，△P＜0．01

組別 W（g） H（cm） AC（cm）A 組 155．75±21．34 15．75±1．75 12．33±1．73 B組 192．88±35．86＊ 18．88±1．64＊ 14．75±0．89△

3 兩組大鼠血FPG、FINS、血脂及SAT與PAT Vaspin mRNA相對表達水平測定結果：兩組大鼠FPG、FINS、TC、TG、LDL、HDL及PAT Vaspin mRNA相對表達水平差異均有統計學意義（P＜0．05），B組大鼠 FPG、FINS、TC、TG、LDL 及 PAT Vaspin mRNA相對表達水平均高于A組，HDL水平低于A組，SAT Vaspin mRNA相對表達水平差異無統計學意義（P＞0．05），見表4。

表4 兩組大鼠FPG、FINS、血脂及SAT與PAT Vaspin測定結果（±s，n＝8）

表4 兩組大鼠FPG、FINS、血脂及SAT與PAT Vaspin測定結果（±s，n＝8）

注：與A組比較，＊P＜0．05

組別 FPG（mmol／L）FINS（mIU／L） TC（mmol／L） TG（mmol／L） LDL（mmol／L）HDL（mmol／L） SATVaspin PAT Vaspin A組 5．20±0．31 24．35±6．50 3．53±0．31 0．74±0．12 1．29±0．23 1．27±0．13 1．00±0．00 2．41±0．24 B組 5．67±0．33＊ 36．21±7．11＊ 4．60±0．32＊ 1．09±0．15＊ 2．24±＋0．24＊ 1．03±0．10＊ 1．02±0．15 3．31±0．27＊

討 論

Vaspin是Hida等［4］于2005年首次在肥胖大鼠內臟脂肪組織分離到的具有胰島素增敏作用的脂肪細胞因子，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的典型特征，主要由脂肪細胞分泌，在肥胖大鼠的脂肪組織中高表達，低或不表達于消瘦大鼠的非脂肪組織，Vaspin在白色脂肪組織特異性表達，免疫組化證實其定位在胞質中，也分布到血循環。研究顯示，血清Vaspin濃度具有明顯的性別差異性，女性高于男性，且超重的多囊卵巢綜合癥患者血清Vaspin水平顯著高于年齡、BMI和WHR匹配的非多囊卵巢綜合征的正常女性［5］，其睪酮、雄烯二酮、血清雌二醇和硫酸脫氫表雄酮亦顯著升高。進一步用不同劑量的睪酮、雄烯二酮、雌二醇和硫酸脫氫表雄酮處理網膜脂肪細胞，發現雌二醇呈劑量依賴性的增加Vaspin的表達，而硫酸脫氫表雄酮可顯著增加Vaspin凈蛋白的合成，故有學者認為Vaspin可能與瘦素、脂聯素一樣也受性激素或腎上腺激素的調控，但Vaspin性別差異性的具體原因仍有待于進一步的研究。Li等［6］研究發現，運動員組血清Vaspin濃度與糖耐量正常組相比顯著降低，且正常對照組在經過4周運動后血清Vaspin濃度較運動前亦明顯降低；此外，行胃旁路術術后1年受試者體重下降，血清Vaspin、瘦素、胰島素、C肽、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數均降低，即血清Vaspin水平與總體脂含量正相關，然而2型糖尿病患者的血清Vaspin水平與BMI并不存在相關性，無2型糖尿病的肥胖患者與對照組相比其脂肪組織Vaspin mRNA的表達顯著增加［7］。

本試驗中大鼠斷乳后直接給予高脂飼料喂養4周，幼鼠體重超過普通飲食組大鼠體重的20%，且AC、FPG、FINS、TC、TG、及 LDL明顯升高，HDL水平降低，結果提示高脂飲食誘導的肥胖大鼠模型建立成功。雌性肥胖大鼠與對照大鼠PAT與SAT均可檢測到Vaspin mRNA表達，這與以往研究［3］顯示不僅高脂誘導肥胖雄性大鼠附睪脂肪組織、SAT中均能檢測到Vaspin蛋白，正常大鼠附睪脂肪組織、SAT中也可以檢測到少量Vaspin蛋白表達一致；PAT Vaspin mRNA水平明顯升高，SAT Vaspin mRNA水平差異無統計學意義，即與SAT相比，內臟脂肪組織具有更為活躍的內分泌功能。

除高脂飲食，Vaspin水平還受進餐、日周期等因素影響［7，8］，并且與肥胖相關的血管并發癥如糖尿病的血管并發癥、高血壓以及動脈粥樣硬化等有關［9，10］。Vaspin的胰島素增敏的作用機制尚不清楚。有研究發現［11，12］，Vaspin通過調控白色脂肪組織中與胰島素抵抗相關基因（如瘦素、抵抗素、腫瘤壞死因子－α、白細胞介素－6、葡萄糖轉運體－4、可溶性瘦素受體和脂聯素）的表達而改善胰島素抵抗。然而，在體外小鼠脂肪細胞培養液中加入Vaspin，或者給非肥胖的小鼠注射Vaspin并不能增加組織的葡萄糖攝取率或改善糖耐量［3］。由此推測，某種條件下的肥胖狀態Vaspin發揮了靶向增加白色脂肪胰島素敏感性的功能，可能抑制某種來源于脂肪組織或其他組織的未知的蛋白酶，而這種蛋白酶在體內可能具有削弱胰島素敏感性的作用。因此，Vaspin改善胰島素抵抗的作用可能需在其靶蛋白酶存在的條件下才能奏效，但Vaspin的靶蛋白酶迄今尚未知曉，有待進一步研究證實。

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