日本三角渦蟲全能干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

摘要：渦蟲具有極強(qiáng)的再生能力，并且認(rèn)為渦蟲體內(nèi)存在一類具有增殖分化潛能被稱為neoblasts的全能干細(xì)胞。這種細(xì)胞在渦蟲體內(nèi)可發(fā)生遷移、增殖和分化，對其個體組織器官損傷的修復(fù)具有重要作用。本實驗中，三角渦蟲經(jīng)過饑餓處理后切取特定的組織塊，然后再經(jīng)過處理使組織塊中的細(xì)胞分離出來。分離的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并通過堿性磷酸酶檢測最終鑒定為neoblasts干細(xì)胞。

關(guān)鍵詞：三角渦蟲；全能干細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；鑒定

中圖分類號：Q959.151+.302文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0034-04

渦蟲（Planarian）是動物界最早出現(xiàn)兩側(cè)對稱、三胚層、營自由生活的扁形動物，也是由水生向陸生過渡的重要類群，因而在動物系統(tǒng)演化中占有重要地位[1]。渦蟲國內(nèi)分布廣泛，進(jìn)化地位十分重要，是發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和再生生物學(xué)、進(jìn)化和遺傳學(xué)研究的好材料。Kawakatsu認(rèn)為中國的淡水三角渦蟲全部屬于三角渦蟲屬中的日本三角渦蟲（Dugesia japonica Ichikawa et Kawakatsu）[2]。不同的地區(qū)和環(huán)境對其生殖具有一定影響，但大多以有性和無性方式交替進(jìn)行。渦蟲具有極強(qiáng)的再生能力，已知如果把渦蟲切割成許多小的片段，一周內(nèi)它可以重新長成完整的個體[3，4]。其再生潛能歸因于體內(nèi)一類稱為“neoblasts”的細(xì)胞群，這是成體渦蟲體內(nèi)僅有的一類具有增殖分化潛能的干細(xì)胞，即成體未分化細(xì)胞[5～7]。它在整個個體的間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)都有分布，而在其它類型細(xì)胞如上皮細(xì)胞、腸細(xì)胞、腦部分布較少；在生長、喂養(yǎng)、饑餓狀態(tài)下細(xì)胞狀態(tài)也處于動態(tài)的變化[8～9]。其體內(nèi)neoblasts約占全部細(xì)胞的30%，是一種全能干細(xì)胞，可分化為體內(nèi)的40多種細(xì)胞，因此成為研究胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化與去分化分子機(jī)理的理想材料[10]。

迄今為止，體外分離干細(xì)胞技術(shù)已有很多報道，建立在對細(xì)胞表面標(biāo)記物的識別基礎(chǔ)上用來純化干細(xì)胞的標(biāo)記包括CD34、AC133、STRO-1、神經(jīng)營養(yǎng)受體p7520等[11]。分離方法包括熒光標(biāo)記細(xì)胞分選、免疫磁分離和免疫吸附柱分離；密度梯度離心法從單個核細(xì)胞中分離干細(xì)胞也用于渦蟲干細(xì)胞的分離[12～13]，但這種方法要求的實驗器材與熟練程度都比較高且操作繁瑣，因此不常用。常用的分離哺乳動物干細(xì)胞的方法是通過胰酶處理組織塊，使之消化成單個細(xì)胞，再用培養(yǎng)液培養(yǎng)，但處理時會對細(xì)胞造成一定程度的損傷。在現(xiàn)代再生科學(xué)方面，最早嘗試培養(yǎng)渦蟲細(xì)胞是在芝加哥Ch.M.Child’s實驗室[14]。但是直到目前，沒有任何關(guān)于穩(wěn)定培養(yǎng)扁形動物細(xì)胞系的報道。最近有neoblasts細(xì)胞重要性及其分子相關(guān)實驗方面的報道，所以在借鑒國外分離日本三角渦蟲全能干細(xì)胞neoblasts方法的基礎(chǔ)上，摸索建立穩(wěn)定的neoblasts細(xì)胞系非常重要[15～17]。

干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中含有較高的堿性磷酸酶（ALP），而已分化的細(xì)胞中活性明顯降低。在堿性磷酸酯酶的催化下，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸（BCIP）會被水解產(chǎn)生強(qiáng)反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍(lán)色至藍(lán)紫色的NBT-formazan產(chǎn)物，所以利用這一點可以鑒定細(xì)胞是否為干細(xì)胞[18～19]。本實驗初步摸索了一種分離培養(yǎng)及鑒定渦蟲全能干細(xì)胞neoblasts的方法，為下一步開展渦蟲相關(guān)方面的研究提供了一定的基礎(chǔ)。