表達hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮細胞系的建立

摘要：構建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T載體，線性化后，共轉染荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞，研究人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）和猿猴病毒40大T抗原（SV40 T）對荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞體外培養的作用，并對細胞進行RT-PCR檢測分析及免疫熒光鑒定。結果表明， hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮細胞中表達可以有效地延長細胞的體外培養時間，增加細胞傳代次數，獲得的細胞系可以正常表達角蛋白。說明在體外培養的乳腺細胞中共表達hTERT和SV40 T可以有效延長細胞壽命且不影響乳腺細胞特性。

關鍵詞：荷斯坦奶牛乳腺上皮細胞；永生化；端粒酶；猿猴空泡病毒40大T抗原

中圖分類號：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0001-04

乳腺上皮細胞具有合成和分泌乳汁的功能，在體外培養條件下仍可保持其特性，該特性在制備動物乳腺生物反應器及研究外源基因在細胞水平的表達具有重要意義[1～3]。另外，利用乳腺上皮細胞的模型，還可以在體外研究某些激素、因子等對乳腺上皮細胞的影響，分析乳腺分泌的活性物質與乳腺疾病發生之間的關系，同時也可以用于乳腺發育調控的研究[4]。但是，乳腺上皮細胞在體外傳代次數有限，且細胞活性與體外培養時間呈負相關，通過正常培養的手段獲得可以用于體外研究的乳腺上皮細胞具有很大的難度，正常體外研究中缺少乳腺細胞模型，這嚴重制約了外源基因在細胞水平表達的研究。因此，通過一些方法延長乳腺上皮細胞體外培養時間，甚至得到永生化的乳腺上皮細胞是非常有意義的。

人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）在激活端粒酶的過程中發揮著關鍵作用，在體外培養的細胞中，可以有效激活端粒酶，活化的端粒酶再以其自身為模板不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒的長度，有效維持端粒縮短和延長的動態平衡，恢復染色體的穩定性，使細胞得以逾越M1和M2期，獲得無限分裂和增殖的能力，進而延長細胞體外培養時間或者永生化，同時hTERT的表達又不會使細胞的生物學特征發生改變，因此受到了越來越多的關注[5～9]。SV40 T雖然是一種病毒蛋白，但其在端粒酶的活化、生長抑制因子的失活等多方面亦發揮著積極的作用[10～13]。

本研究以荷斯坦奶牛乳腺細胞為材料，以真核表達載體pcDNA3.1（+）為骨架，構建表達載體pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40 T，線性化后電轉染乳腺上皮細胞，以期獲得體外永生化的乳腺上皮細胞系，為在乳腺細胞水平上研究外源基因的分泌及基因功能研究奠定基礎。