山東地區牛傳染性鼻氣管炎病毒的分離鑒定

摘要：從山東某地區發生呼吸道癥狀的奶牛場中采集樣品，按常規方法處理后，接種牛腎細胞（MDBK），分離病毒，盲傳3代后，接種病料的MDBK細胞出現細胞圓縮、聚集成葡萄串樣群落、在單層細胞上形成空洞等病變，且隨著傳代次數的增加，細胞病變更加規律。對所分離病毒進行TCID50測定，其TCID50值為108/ml；用IBRV特異性引物對分離病毒進行PCR擴增，獲得與設計基因片段大小一致的特異性條帶，序列測定分析結果確認所分離病毒為牛傳染性鼻氣管炎病毒。

關鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎病毒；分離鑒定；聚合酶鏈式反應

中圖分類號：S858.237.7（252）文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0028-03

牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus， IBRV）引起的牛傳染性鼻氣管炎是牛的主要呼吸道疾病之一。臨床以病牛體溫升高、呼吸困難、鼻炎和上流鼻涕及鼻孔內出現糜爛或白色結節為特征，還可導致生殖道感染從而進一步導致母畜流產及產死胎等病癥，繼發性的細菌感染能導致更嚴重的呼吸道疾病[1～3]。美國于1955年首次發現以傳染性鼻氣管炎癥狀為特征的疾病，1956年Madin首次從患牛中分離出IBRV，20世紀70年代起蔓延整個歐洲。迄今為止，世界大多數國家都有發生牛傳染性鼻氣管炎的報道，同時IBR根除計劃在其他一些國家開始實施[4]。我國于20世紀70年代末從新西蘭進口的奶牛中分離到一株IBRV，隨后陸續從國內部分省份的血清學調查中檢測到IBR抗體的存在[5]。該病主要影響奶牛繁殖能力、產奶量及使役牛的使役能力，嚴重影響著國際牛業生產貿易，已被世界動物衛生組織（OIE）列為B類傳播性疾病，也被我國列為二類動物傳染病[6]。

2012年本研究室對山東某地區發生呼吸道癥狀的奶牛場進行樣品采集，進行處理后接種細胞盲傳，經培養分離到一株牛傳染性鼻氣管炎病毒，同時我們還對病毒的生物學特性進行了初步研究。

1材料與方法

1.1供試材料

MDBK細胞購自中國典型培養物保藏中心；IBRV標準毒株購自中國獸醫藥品監察所；磷酸緩沖液（PBS）、DMEM培養液、胰酶均購自Invitrogen公司；優級胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；LA Taq with GC buffer、dNTP Mixture、DL2000 DNA Marker均為大連寶生物工程有限公司產品；T3載體為北京全式金生物技術有限公司產品。

1.2病毒的分離培養

將MDBK細胞傳代，細胞長到對數生長期時，按0.5 ml每皿（100 mm培養皿）接種分離獲得的無菌血液樣品，置于37℃培養箱中孵育1.5 h（間隔30 min輕搖一次）；去除接種液，用PBS沖洗2次，加入7 ml含有2%FBS的維持液，置于5%CO2的37℃培養箱中培養。每天觀察細胞病變（CPE），待70%～80%細胞出現CPE時收毒；如果細胞不出現CPE，則7天后盲傳，分離物傳至第3代。

1.3病毒TCID50的測定