小鼠MCK基因啟動(dòng)子的克隆及其活性初步分析

摘要：本研究克隆了小鼠MCK基因5′側(cè)翼區(qū)以及核心啟動(dòng)子區(qū)，并分析和研究了其調(diào)控活性。首先以小鼠尾部肌肉基因組DNA為模版克隆了小鼠MCK基因5′側(cè)翼區(qū)序列，回收純化，連接pEASY-T3 Cloning載體，測(cè)序，分析了其增強(qiáng)子與核心啟動(dòng)子序列。然后將核心啟動(dòng)子序列亞克隆到無(wú)啟動(dòng)子的熒光蛋白報(bào)告載體pGL3-Venus中，轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞C2C12，觀察其在熒光顯微鏡下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，小鼠MCK基因-1354 ～ +1 bp核心啟動(dòng)子序列能調(diào)控Venus熒光蛋白在C2C12細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，證實(shí)MCK啟動(dòng)子核心序列具有組織特異性調(diào)控能力。

關(guān)鍵詞：小鼠；MCK基因；啟動(dòng)子；序列分析

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0005-06

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中，外源基因都需要在某種組織中特異性表達(dá)，因此，組織特異性啟動(dòng)子對(duì)于外源基因組織特異性表達(dá)具有重要作用。另外，組織特異性啟動(dòng)子是研究細(xì)胞分化、基因工程以及再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的重要工具。據(jù)報(bào)道，由肌肉特異性調(diào)控元件構(gòu)成的啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)載體進(jìn)行肌肉特異性表達(dá)，在非肌肉細(xì)胞中表達(dá)很低[1]，這些調(diào)控元件包括肌酸激酶（Creatine Kinase， CK）調(diào)控元件[2]、骨骼肌肌動(dòng)蛋白調(diào)控元件[3]、肌球蛋白重鏈調(diào)控元件[4]和其他肌肉基因的調(diào)控元件。高等脊椎動(dòng)物肌酸激酶存在胞質(zhì)型和線粒體型兩大類，其中胞質(zhì)型包括肌肉型肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase， MCK）和腦型肌酸激酶（Brain Creatine Kinase， BCK）兩種形式，而在線粒體中存在CKmt1和CKmt2兩種類型的肌酸激酶[5]。肌肉肌酸激酶基因主要存在于各種肌肉細(xì)胞中，骨骼肌和心肌中都含有肌酸激酶，尤其骨骼肌含量最為豐富，占全身總量的96%，在收縮肌肉中被轉(zhuǎn)錄激活，在成年心肌和骨骼肌中高度表達(dá)[6]。

目前，外源基因在肌肉中表達(dá)主要應(yīng)用巨細(xì)胞病毒（Cytomegaoviyns， CMV）啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子雖然高效，但外源基因表達(dá)沒(méi)有細(xì)胞特異性[7]，因此，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用中受到極大地限制。考慮到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后期應(yīng)用的生物安全評(píng)價(jià)，所以選取更適合自然界存在的肌肉特異性啟動(dòng)子顯得極為重要。在研究相關(guān)基因在肌肉發(fā)育過(guò)程中的作用及對(duì)肌肉形成的影響，特別是在肉用方面的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究與應(yīng)用中及肌肉性疾病治療性研究中，肌肉特異性啟動(dòng)子的研究就成了熱點(diǎn)。

本研究首先克隆了小鼠MCK 5′側(cè)翼區(qū)序列，并分析了其核心啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)，然后克隆了小鼠的MCK核心啟動(dòng)子，將其連接到帶有熒光蛋白的報(bào)告載體中，轉(zhuǎn)染肌肉細(xì)胞驗(yàn)證其具有轉(zhuǎn)錄活性，為進(jìn)一步研究MCK啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。