奶牛腹腔巨噬細胞的分離與鑒定

摘要：以無血清的RPMI-1640培養液灌洗奶牛腹腔，分離獲取奶牛腹腔巨噬細胞，在含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中培養。采用倒置顯微鏡觀察細胞形態，并通過瑞氏染色計算其純度。結果表明，采用無血清的RPMI-1640培養液灌洗奶牛腹腔，能夠獲得較高純度的巨噬細胞，能為奶牛胞內寄生菌存活機制的研究提供很好的試驗材料。

關鍵詞：奶牛；巨噬細胞；分離培養

中圖分類號：S823.9+1；Q813文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0038-03

巨噬細胞（Macrophage）為免疫活性細胞，是機體免疫系統的重要細胞，在機體固有和適應性免疫功能中扮演著極其重要的角色，可作為抗原呈遞細胞在誘導特異性免疫反應中發揮重要作用，其產生的可溶性細胞活素類因子參與調節特異性免疫反應。巨噬細胞也是各類病原的靶細胞[1]，包括分支桿菌、沙門氏菌、衣原體等。

腹腔巨噬細胞是腹腔抗感染的第一道防線，是研究機體自然免疫和獲得性免疫關系的重要研究材料。但是迄今為止的報道多為有關小動物如大鼠、豚鼠、小鼠的腹腔巨噬細胞的分離鑒定，綿羊[2]、豬[3]、牛[4]等大家畜也有肺泡巨噬細胞分離的報道，尚未見有關奶牛腹腔巨噬細胞分離鑒定的方法。因此，本研究擬運用RPMI-1640培養液灌洗奶牛腹腔的方法，獲得高純度、高活性的腹腔巨噬細胞并進行相關鑒定，為下一步構建奶牛巨噬細胞噬菌體文庫和以巨噬細胞為模型研究奶牛免疫機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

RPMI-1640培養基購自Hyclone，小牛血清購自天津灝洋生物工程公司，酸性磷酸酶染液、α-醋酸萘酚酯酶染液，HE染液試劑盒購自南京建成科技有限公司，瑞氏-姬姆薩染色液購自濟南百博生物技術有限公司；儀器主要有CO2培養箱、倒置顯微鏡。

1.2奶牛腹腔巨噬細胞的分離培養

購15日齡雄性奶牛1只，平躺保定，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培養液500 ml，輕柔奶牛腹部3～5 min，靜置7～10 min后，用50 ml注射器抽取腹腔液。離心5 min（1 000 r/min），棄上清，用PBS洗滌3遍，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液調節細胞濃度至2×106個/ml，接種于培養瓶及6孔培養板，置于37℃、5%CO2培養箱培養2 h，棄上清液，用不含小牛血清的RPMI-1640培養液漂洗2遍，然后加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養液在37℃、5%CO2培養箱繼續培養，并作相關染色和鑒定。

1.3培養細胞的形態學觀察

體外培養6 h后，將培養瓶置于倒置顯微鏡下觀察貼壁細胞形態；取已鋪滿細胞的爬片，晾干后進行姬姆薩染色，光學顯微鏡下觀察細胞形態。

1.4奶牛腹腔巨噬細胞HE染色

取出細胞爬片，固定晾干，按照說明進行染色。

1.5奶牛腹腔巨噬細胞酶化學測定

1.5.1酸性磷酸酶染色（CACP） 取出細胞爬片，固定，晾干，按照說明進行染色。每片計數200個細胞，共觀察5片，計算陽性率（胞漿內有棕紅色顆粒沉淀物為陽性，胞漿內粉紅色為陰性）。

1.5.2非特異性酯酶染色 取出細胞爬片，固定，晾干，放入含10%α-醋酸萘酯的基質液（pH=6.3）中孵育1 h，流水沖洗3 min，晾干。甲基綠復染3 min，流水沖洗，晾干鏡檢。每片計數200個細胞，共觀察5片，并計算陽性率（胞質內有灰黑色沉淀物為陽性，胞質內無沉淀物為陰性。2結果與分析

2.1奶牛巨噬細胞培養及形態特性