牛流行熱病毒山東地方株的分離與鑒定

摘要：利用BHK-21細胞，接種山東濟南地區疑似牛流行熱病牛高熱期的抗凝血，經盲傳3代，分離到1株病毒，經RT-PCR鑒定為牛流行熱病毒，命名為BEFV-SD。理化特性試驗表明：BEFV-SD對熱敏感，56℃ 10 min、37℃18 h可被滅活，對乙醚、氯仿等敏感；BEFV-SD可被BEFV陽性血清中和，中和效價為1∶408；將BEFV-SD的G基因與GenBank中公布的BEFV進行同源性比較，同源性達到96.3%以上。

關鍵詞：牛流行熱病毒；分離；鑒定；同源性

中圖分類號：S855.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0031-04

牛流行熱 （Bovine Ephemeral Fever，BEF）是由牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）引起的牛和水牛的一種急性、熱性傳染病，其特征是突發高熱、呼吸迫促、消化機能障礙、全身虛弱、僵硬、跛行[1]。首先發現于19世紀中期的東非，隨后流行于非洲、亞洲和大洋洲許多國家和地區[2～5]。本病流行具有明顯的季節性，多發生于雨量多和氣候炎熱的7～10月。該病傳播迅速，流行面廣，有一定的周期性[6]，曾在我國多個省份多次發生，導致奶牛產奶量降低，乳品質下降，役用牛跛行或癱瘓，部分懷孕母牛流產，給養牛業造成重大經濟損失。本實驗室采集了疑似患牛流行熱病牛高熱期的抗凝血，進行了病原分離，經各項試驗鑒定，證實分離獲得了牛流行熱病毒。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1病料來源采集山東省濟南市周邊出現急性發熱、呼吸道和消化道機能障礙的奶牛高熱期的靜脈血，肝素鈉抗凝，-20℃保存。

1.1.2實驗材料100 mm培養皿、96孔培養板為Costar產品，DMEM營養液、胎牛血清購自Giboco公司，RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、DL2000 DNA Marker等分子生物學試劑購自大連寶生物工程公司，瓊脂糖、溴化乙腚等試劑購自上海生工生物技術有限公司，BHK-21細胞為山東省農科院奶牛研究中心實驗室保存。

1.1.3引物設計與合成根據牛流行熱病毒主要免疫保護性糖蛋白G（BEFV-G）的保守核苷酸序列 （GenBank登錄號為AF234533.1） 設計引物BEFJ1（5′-AGAGCTTGGTGTGAATAC-3′）和BEFJ2（5′-CCAACCTACAACAGCAGATA-3′），擴增片段大小為420 bp，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒的分離與傳代將臨床疑似牛流行熱的病牛抗凝血反復凍融3次后，4℃離心（4 000 r/min）5 min后取上清，接種于長滿單層的BHK-21細胞，37℃吸附1 h，加入含有2%胎牛血清的DMEM細胞維持液，連續3 d觀察是否出現細胞病變（CPE），若未發生CPE盲傳3代，仍未出現CPE且RT-PCR鑒定為陰性者廢棄，陽性者繼續傳代，直至出現CPE，當出現80%CPE時收毒，凍融3次后，繼續傳代3次。經無菌檢驗合格后，小管分裝，-70℃凍存備用。并按方法1.2.2進行病毒的RT-PCR鑒定。

1.2.2RT-PCR檢測病牛的抗凝血及培養病毒液反復凍融3次后，用病毒RNA提取試劑盒提取RNA，反轉錄cDNA， 進行PCR擴增。PCR反應體系為：10×buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 1.8 μl，10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.7 μl，模板DNA 1.5 μl， Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，加三蒸水至25 μl。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，56℃復性30 s，72℃延伸30 s，35個循環；最后72℃延伸3 min。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3病毒理化特性試驗對分離毒種的第6代BHK-21細胞培養物進行理化特性鑒定，用終濃度50 mg/L的5-碘脫氧尿核苷處理分離毒種，鑒定病毒的核酸型；用乙醚、氯仿處理分離毒種，進行脂溶性敏感試驗；用pH 3.0的鹽酸處理分離毒株進行耐酸性試驗；56℃水浴10～30 min，37℃孵育12～36 h，對分離毒株進行耐熱性試驗，同時分別設立對照組。

1.2.4中和試驗采用固定病毒稀釋血清的方法，將200 TCID50/100μl分離株病毒液與等量的不同倍比稀釋度的BEFV陽性血清充分混合， 37℃感作1 h，將每個混合液接種于棄去生長液的長滿單層BHK-21細胞的96孔細胞培養板中，37℃吸附1 h后，每孔加細胞維持液 100 μl，置于37℃、5% CO2 培養箱靜置培養7 d，逐日觀察CPE 情況并記錄。同時設立血清毒性對照、陰性血清對照和空白試驗對照。

1.2.5分離病毒株的G蛋白編碼區的克隆測序及其同源性比較對分離病毒株進行RNA提取，然后進行G蛋白編碼區的RT-PCR擴增，擴增片段為1 872 bp，純化PCR產物，克隆到T3載體，送上海生工測序，對獲得分離株的G蛋白序列進行同源性比較和進化樹分析。

2結果與分析

2.1分離病毒可見致細胞病變效應

將臨床疑似牛流行熱的病牛抗凝血接種長滿80%的單層BHK-21細胞，盲傳3代后，出現細胞病變，特征為細胞開始變圓，胞質內顆粒增多，融合成小集落（見圖1B），然后細胞全部變圓（圖1C），脫落死亡。將獲得的病毒進行繼代培養，傳至3代后，細胞病變規律、典型，將此分離毒株命名為BEFV-SD。