陸地棉GhBI—1基因在擬南芥中的異位表達及耐鹽性研究

摘要：前期工作中，我們從陸地棉基因組中分離了GhBI-1基因全長cDNA，構建了GhBI-1過量表達載體并轉化擬南芥。本研究在此基礎上，利用卡那初步篩選獲得轉基因擬南芥，通過PCR進一步驗證，得到具有卡那抗性并且遺傳穩定的T3代純合株系。利用不同濃度NaCl處理野生型和轉GhBI-1基因擬南芥，結果表明，轉基因擬南芥在200 mmol/L NaCl脅迫后，萌發率和生長情況要好于野生型擬南芥，過量表達GhBI-1基因能夠提高擬南芥耐受鹽脅迫的能力。

關鍵詞：陸地棉；GhBI-1基因；異位表達；耐鹽性

中圖分類號：Q786文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）04-0001-04

我國棉花種植區多為鹽堿和干旱地區，鹽害是影響棉花生長的主要因素。活性氧（ROS）的產生是高濃度鹽對植物細胞造成傷害的主要原因。活性氧幾乎可以與所有生物大分子反應，造成脂類和蛋白質代謝異常。在高鹽脅迫下，植物細胞進行一系列復雜的分子反應，包括合成脅迫應答蛋白和滲透保護物質，這些表達產物通過清除ROS或防止ROS破壞細胞結構起到解毒作用[1]。

目前，已有多篇報道闡述了BI-1基因的功能[2～4] 。BI-1基因能夠抑制由生物或非生物脅迫引起的程序性細胞死亡[5]。BI-1蛋白位于內質網膜，與內質網應激有密切關系。BI-1蛋白包含6～7個跨膜螺旋結構，可能形成離子通道，調節ROS產生后的細胞死亡信號[6]。前期研究中，本實驗室利用陸地棉幼苗根部cDNA文庫中部分BI-1基因序列（500 bp），自陸地棉基因組中克隆了GhBI-1基因的全長cDNA[7]。熒光定量結果表明，250 mmol/L NaCl處理72 h后，棉花幼苗根中GhBI-1的表達水平分別在處理2 h和24 h時出現高峰，GhBI-1基因受鹽誘導表達上調[8]，暗示GhBI-1基因可能與耐鹽性相關。為了深入研究該基因的功能，構建了由CaMV35S 啟動子驅動GhBI-1基因表達的植物表達載體并轉化擬南芥。本試驗在前期工作的基礎上，通過卡那篩選和PCR鑒定，獲得了過量表達GhBI-1基因的轉基因擬南芥純合子。耐鹽性分析表明，轉基因擬南芥的耐鹽性較野生型擬南芥有一定程度的提高。

1材料與方法

11試驗材料

14轉基因擬南芥的耐鹽性檢測

將野生型與轉基因擬南芥純合子種子分別播種于含有0、100、200 mmol/L NaCl的MS固體培養基上，培養14 d后，統計不同濃度鹽處理后種子的萌發率，觀察根部的生長情況；野生型與轉基因擬南芥純合子種子在不含NaCl的MS培養基上培養7 d后，選擇生長一致的擬南芥幼苗移栽到含有0、200 mmol/L NaCl的MS固體培養基上處理7 d，觀察它們的生長情況，統計白化率。

2結果與分析

21轉基因擬南芥的卡那篩選

經過卡那抗性篩選，得到具有抗性的T1代轉基因擬南芥10株，提取基因組DNA，以此為模板進行PCR檢測，10個轉基因株系均可擴增出目的片段（860 bp），野生型擬南芥模板擴增不出任何條帶（圖1）。將轉基因株系繁育至T3代，在含有卡那的MS平板上不再分離的株系為純合系。在T1篩選過程中符合分離比3∶1的有5個系，為單拷貝插入。我們對這5個株系進行下一步研究。

23轉基因擬南芥的耐鹽性檢測

將OE2～5的T3代種子和野生型種子播種在含不同濃度NaCl（0、100、200 mmol/L）的MS培養基上，在短日照培養14 d左右，觀察擬南芥種子的萌發情況并進行統計。由于在不含NaCl的MS培養基上，野生型擬南芥種子的萌發率高于轉基因擬南芥種子，因此，我們把野生型和轉基因擬南芥種子在不含NaCl的MS培養基上的萌發率看作100%，不同濃度NaCl脅迫的萌發率以此校正為相對萌發率。在含100 mmol/L NaCl的MS培養基上，野生型及轉基因擬南芥種子的萌發率并未受到顯著影響。在含200 mmol/L NaCl的MS培養基上，OE2、OE3的相對萌發率（89%和88%）比野生型（74%）明顯提高，OE4、OE5的相對萌發率與野生型的差別不大（表1）。

3討論與結論

BI-1是細胞凋亡的調控因子，普遍存在于原核和真核細胞中，在進化上非常保守。缺失BI-1的小鼠未發現嚴重的組織異常[9]，說明它并不是細胞凋亡的必需因子，而是調節內質網應激有關的細胞凋亡過程。內質網脅迫信號通路不僅參與植物內質網動態平衡，還在植物的其他生物過程，如對病原體和非生物脅迫的響應方面具有重要作用。在植物細胞中，BI-1可能具有調控由脅迫引發的程序性細胞死亡的功能[10]。

植物遭受非生物脅迫（如高鹽脅迫）后，代謝發生紊亂，導致ROS增加[11]。研究發現，細胞的膜脂和膜蛋白受到鹽脅迫的直接影響，出現透性增大和膜脂過氧化水平升高，導致膜的完整性被破壞，其差別透性喪失，電解質及某些小分子有機物大量滲漏，細胞物質交換平衡遭到破壞，而植物防御體系被膜脂過氧化產物的破壞又加劇了膜脂的過氧化程度[12]。ROS可能激活了內質網內的程序性細胞死亡通路[13]。BI-1蛋白具有6或7個跨膜螺旋結構，形成離子通道，參與了內質網應激反應，在ROS生成后，調節細胞死亡信號[7]。