糖尿病患者結(jié)合珠蛋白基因多態(tài)性與冠脈狹窄相關(guān)性研究

[摘要] 目的 探討糖尿病患者結(jié)合珠蛋白基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈狹窄嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 方法 選擇98例糖尿病合并冠心病患者以及77例單純糖尿病患者，采用PCR-SSP技術(shù)檢測結(jié)合珠蛋白基因型，據(jù)此對(duì)糖尿病合并冠心病患者進(jìn)行分組，采用Gensini冠狀動(dòng)脈評(píng)分系統(tǒng)（Gensini積分）對(duì)冠狀動(dòng)脈的狹窄程度進(jìn)行評(píng)分。 結(jié)果 糖尿病合并冠心病組Hp基因型分布與單純糖尿病組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表現(xiàn)為Hp2-2基因型在糖尿病合并冠心病組的頻率明顯高于單純糖尿病組（0.55 vs 0.35，P < 0.05）。糖尿病合并冠心病組間，Hp2-2基因型組的Gensini 積分明顯高于Hp1-1/Hp1-2 基因型組（P < 0.05）。 結(jié)論 Hp2-2基因型可能與糖尿病患者冠心病的發(fā)生相關(guān)，且與糖尿病患者冠脈狹窄的嚴(yán)重程度相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病；結(jié)合珠蛋白（Hp）；基因多態(tài)性；冠狀動(dòng)脈狹窄

[中圖分類號(hào)] R541.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）01-0030-03

糖尿病已經(jīng)成為動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病最重要的危險(xiǎn)因子，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化過程中有重要作用。研究顯示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與基因的多態(tài)性有關(guān)[1，2]。結(jié)合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）又稱觸珠蛋白，是一種酸性糖蛋白，屬急性期反應(yīng)蛋白之一，具有抗氧化活性、抑制前列腺素合成、促進(jìn)血管生成及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等功能[3]。人類Hp基因位于染色體16q22.1，存在基因多態(tài)性，表現(xiàn)為Hp1-1、Hp1-2和Hp2-2三種基因型[4]。國外研究發(fā)現(xiàn)Hp2-2基因型是糖尿病患者心血管并發(fā)癥出現(xiàn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，Hp2-2基因型的糖尿病患者更容易出現(xiàn)心血管并發(fā)癥。本研究采用PCR-SSP技術(shù)檢測結(jié)合珠蛋白基因型，采用Gensini積分對(duì)冠狀動(dòng)脈的狹窄程度進(jìn)行評(píng)分，探討糖尿病患者結(jié)合珠蛋白基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)生及冠脈狹窄嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年5月～2011年1月青島市市立醫(yī)院西院心內(nèi)科經(jīng)過冠脈造影確診的98例糖尿病合并冠心病患者，其中男60例，女38例，年齡47～77歲，平均（57.72±9.95）歲，以及同期經(jīng)冠脈造影或冠脈CTA檢查排除冠心病的77例單純糖尿病患者，其中男48例，女29例，年齡48～76歲，平均（58.64±10.14）歲。糖尿病診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.1 采用Judkins法行選擇性冠脈造影檢查 每支冠狀動(dòng)脈均經(jīng)多體位投照。冠心病的診斷根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合冠脈造影結(jié)果，至少1支冠脈血管狹窄>50%確診為冠心病。采用Gensini 冠狀動(dòng)脈評(píng)分系統(tǒng)（Gensini 積分）對(duì)冠脈的狹窄程度進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)冠脈造影結(jié)果，將冠脈分成14段，狹窄程度以最嚴(yán)重處為標(biāo)準(zhǔn)：狹窄直徑≤25%記1分，狹窄直徑25%～50%記2分，狹窄直徑51%～75%記4分，狹窄直徑76%～90%記8分，狹窄直徑91%～99%記16分，狹窄直徑100%記32分。病變血管不同節(jié)段權(quán)重系數(shù)：左主干×5，前降支近段×2.5，前降支中段×1.5，前降支遠(yuǎn)段×1，回旋支近段×2.5（開口處×3.5），回旋支遠(yuǎn)段、鈍緣支、右冠狀動(dòng)脈、后降支及第1對(duì)角支均×1，第2對(duì)角支及后側(cè)支×0.5。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 所有對(duì)象均做血常規(guī)、肝腎功、血脂、血糖、糖化血紅蛋白、12導(dǎo)聯(lián)心電圖、胸片、心臟彩超，除外既往經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)或冠脈旁路移植術(shù)、心臟瓣膜病、結(jié)締組織病、惡性腫瘤、肝腎功能不全、嚴(yán)重創(chuàng)傷、手術(shù)或感染。半月內(nèi)服用過他汀類調(diào)脂藥、非甾體類消炎藥、抗生素等藥物的患者，均不能入選本研究。

1.2 Hp基因型的檢測

采集受試者的靜脈血2 mL，EDTA抗凝，置于離心機(jī)內(nèi)以1 800 rpm離心10 min，分離出血漿。用天根公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒提取受試者血液DNA。參考Werner Koch[3]對(duì)Hp基因分型的PCR實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分型檢測。用引物A和B擴(kuò)增Hp1特異性的1 757 bp片段，用引物C和D擴(kuò)增Hp2特異性的349 bp片段。上游引物A：5’-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3’，下游引物B：5’-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3’，上游引物C：5’-CCTG-CCTCGTATTAACTGCACCAT-3’，下游引物D：5’-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3’。PCR反應(yīng)體系為模板DNA 5 μL，10×Tap plus Buffer（with MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，Tap plus DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，加入ddH2O補(bǔ)至25 μL體系。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性1 min，69℃退火和延伸2 min（A和B擴(kuò)增時(shí)）或1 min（C和D擴(kuò)增時(shí)），共35個(gè)循環(huán)后72℃終末延伸7 min。PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)125 V 30 min，在紫外光下觀察，攝影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及雙側(cè)概率以P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp基因型分型結(jié)果

如圖1所示，條帶1、3、5為引物A、B擴(kuò)增產(chǎn)物，其中750 bp經(jīng)測序?yàn)锽引物單獨(dú)擴(kuò)增序列，不影響結(jié)合珠蛋白基因分型，條帶1、3含1 757 bp為Hp1等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物；條帶2、4、6為引物C、D擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶4、6含349 bp為Hp2等位基因擴(kuò)增產(chǎn)物。Hp1-1基因型顯示條帶1、2；Hp1-2基因型顯示條帶3、4；Hp2-2基因型顯示條帶5、6。

2.2 兩組一般資料比較

兩組患者一般臨床資料比較，性別、年齡、總膽固醇、低密度脂蛋白、糖化血紅蛋白均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05），見表1。

2.3 兩組Hp2-2基因型頻率比較

兩組的Hp2-2基因型出現(xiàn)頻率分別為0.55 vs 0.35，P < 0.05，兩組間Hp基因型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表現(xiàn)為Hp2-2基因型在糖尿病合并冠心病組的頻率明顯高于單純糖尿病組。見表2。

糖尿病合并冠心病組間，Hp2-2基因型組（n = 54）的Gensini積分（87.72±36.460），Hp1-1/Hp1-2 基因型組（n = 44）的Gensini積分（57.16±25.432），Hp2-2基因型組的Gensini 積分明顯高于Hp1-1/Hp1-2基因型組（P < 0.05）。

3 討論

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化過程中扮有重要作用，Hp屬炎性反應(yīng)急性期反應(yīng)蛋白之一，其主要功能是通過與游離血紅蛋白結(jié)合形成Hp-Hb復(fù)合物，防止過量Hb對(duì)組織的氧化損傷，并阻止Hb從腎小球?yàn)V過，避免Hb對(duì)腎小管的損害及機(jī)體鐵質(zhì)的丟失。Hp可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。人類Hp存在基因多態(tài)性，表現(xiàn)為三種基因型Hp1-1、Hp2-1和Hp2-2。

心血管病的發(fā)病、預(yù)后是否與Hp的基因型有關(guān)一直存有爭議。國外很多大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)表明：Hp基因型雖與糖尿病的發(fā)病沒有關(guān)系，但與糖尿病患者心血管并發(fā)癥的出現(xiàn)有密切聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)，Hp2-2基因型與糖尿病小鼠心梗后的死亡率及更嚴(yán)重的心血管重構(gòu)有關(guān)[6]，Hp2-2基因型是糖尿病患者心血管并發(fā)癥出現(xiàn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，Hp2-2型糖尿病患者發(fā)生冠心病的機(jī)率是其它表型（Hp1-1和Hp2-1）的2～5倍[7]。Suleiman M等對(duì)1 437例發(fā)生心肌梗死患者發(fā)病30 d的死亡率和心衰率進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Hp2-2型糖尿病患者的心梗面積明顯比較大，其心梗死亡率和心衰率是Hp1-1型糖尿病患者的8倍[8]。

研究顯示，Hp2-2基因型頻率在糖尿病合并冠心病組明顯高于單純糖尿病組（0.55 vs 0.35，P < 0.05），在糖尿病合并冠心病組間，Hp2-2基因型組的Gensini積分明顯高于Hp1-1/Hp1-2 基因型組（P < 0.05），提示Hp2-2基因型可能與糖尿病患者冠心病的發(fā)生相關(guān)，Hp2-2 基因型可能與糖尿病患者冠狀動(dòng)脈狹窄的嚴(yán)重程度相關(guān)。這個(gè)結(jié)果與上述的研究結(jié)果一致。可能機(jī)制為：①不同基因型Hp其結(jié)構(gòu)不同，抗氧化劑活性不同， Hp1-1基因型與其他型別相比具有更強(qiáng)的抗氧化活性[9]。②在糖尿病的病理狀況下，Hp的抗氧化能力被削弱，Hp2-2基因型與Hp1-1基因型個(gè)體間抗氧化應(yīng)激的差別被進(jìn)一步放大[10]，導(dǎo)致Hp2-2基因型糖尿病患者體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)普遍比Hp1-1基因型的糖尿病患者高。Asleh等[11]研究亦表明，Hp與糖基化的Hb結(jié)合后較與非糖基化的Hb結(jié)合其抗氧化功能明顯減弱，故可能使氧化修飾的低密度脂蛋白增加對(duì)動(dòng)脈內(nèi)膜造成損傷導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。

綜上所述，Hp2-2基因型可能與糖尿病患者冠心病的發(fā)生密切相關(guān)，可能與冠狀動(dòng)脈狹窄的嚴(yán)重程度相關(guān)。對(duì)于Hp2-2型的糖尿病患者來說，適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充抗氧化劑例如維生素E，可以對(duì)抗心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，根椐Hp基因型對(duì)糖尿病合并冠心病患者開展個(gè)性化抗氧化治療具有可行性。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 段成城，徐力辛，陳倩. 囊泡相關(guān)膜蛋白8基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的相關(guān)性研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2010， 27：329-332.

[2] 王翠平，嚴(yán)金川，杜榮增，等. CD40-1C/T基因多態(tài)性與急性冠脈綜合征易感性的研究[J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2010，19（1）：65-68.

[3] Langlois MR，Delanghe JR. Biological and clinical significance of haptoglobin polymorphism in humans[J]. Clin Chem，1996，42：1589-1600.

[4] 劉海波，施育平，郭小芳，等. 結(jié)合珠蛋白基因1/2多態(tài)性與中國人冠心病易感性的關(guān)聯(lián)研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，2011，28（1）：60-63.

[5] Maes M，Ruckoanich P，Chang YS，et al. Multiple aberrations in shared inflmmatory and oxidative and nitrosative stress（IO and NS）pathways explain the co-association of depression and cardiovascular disorder（CVD），and the increased risk for CVD and due mortality in depressed patients[J]. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011，35（3）：769-783.

[6] Asaf R，Blum S，Roguin A，et al. Haptoglobin genotype is a determinant of survival and cardiac remodeling after myocardial in diabetic mice[J]. Cardiovasc Diabetol，2009，8：29.

[7] Levy AP，Roguin A，Hochberg I，et al. Haptoglobin phenotype and vascular complications in patients with diabetes[J]. N Engl J Med，2000，343：969-970.

[8] Suleiman M，Aronson D，Levy NS，et al. Haptoglobinity polymorphism predicts 30-day mortality and heaIt failure in patients with diabetes and acute myocardial infarction[J]. Diabetes，2005，54：2802-2806.

[9] Tseng CF，Lin CC，Huang HY，et al. Antioxidant role of human haptoglobin[J]. Proteomics，2004，4（8）：2221-2228.

[10] Bamm VV，Tsemakhovich VA，Shaklai N. Oxidation of low-density lipoprotein by hemoglobin-hemichrome[J]. Int J Biochem Cell Biol，2003，35：349-358.

[11] Asleh R，Marsg S，Shilkrut M，et al. Genetieally determined heterogeneity in hemoglobin scavenging and susceptibility to diabetic cardiovascular disease[J]. Circ Res，2003，92：1193-1200.

（收稿日期：2012-10-19）