寶坻大蒜愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系優(yōu)化

摘 要：以寶坻大蒜發(fā)芽葉為外植體，比較了不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效率，優(yōu)化了愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg·L-1 +NAA 2.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1；誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1；誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

關(guān)鍵詞：寶坻大蒜；發(fā)芽葉；愈傷組織；快繁

中圖分類號(hào)：Q945.41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.003

大蒜是百合科蔥屬2年生草本植物，有很強(qiáng)的食用和醫(yī)療保健價(jià)值。大蒜種質(zhì)資源豐富、優(yōu)良品種眾多。但由于采用無(wú)性繁殖， 繁殖系數(shù)低，病毒易積累和傳播，造成品種退化甚至瀕臨滅絕，且不能進(jìn)行雜交育種， 使其遺傳學(xué)和生物學(xué)多樣性得不到充分利用。因此，進(jìn)行種質(zhì)資源創(chuàng)新和新品種培育具有重要意義 。目前已在系統(tǒng)選育[1]、理化誘變[2-3]、有性生殖[4]等方面開(kāi)展了研究。

大蒜脫毒快繁技術(shù)能有效地防止大蒜品種退化，保持優(yōu)良種性，提高繁殖系數(shù)，已建立了較為完善的脫毒培養(yǎng)方法體系[5-7]，但有關(guān)寶坻大蒜的脫毒快繁技術(shù)研究報(bào)道較少，主要以花梗[8]、發(fā)芽葉[9]為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。寶坻大蒜‘六瓣紅’是津沽名優(yōu)特產(chǎn)之一，是全國(guó)大蒜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高的品種。本研究利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，以寶坻大蒜發(fā)芽葉為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生，優(yōu)化了快繁培養(yǎng)基體系，提高了愈傷組織誘導(dǎo)率，為寶坻大蒜的脫毒快繁和種質(zhì)創(chuàng)新打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

寶坻大蒜‘六瓣紅’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配置 以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同種類和濃度的激素，pH值為5.8；高溫高壓滅菌20 min；待冷卻至60 ℃時(shí)，分裝到200 mL的組培瓶中，每瓶約40 mL，封口備用。

1.2.2 外植體的消毒 選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的大蒜蒜頭，剝?nèi)ネ饷骥[葉，挑取個(gè)大、飽滿、無(wú)病斑的新鮮蒜瓣，清水中培養(yǎng)24 h，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗20 min左右，用蒸餾水沖洗1遍，0.1%的升汞消毒10 min，再將其在75%濃度酒精中浸泡5 min，用雙蒸水洗3次，備用。

1.2.3 接種及愈傷組織誘導(dǎo) 接種前，紫外線消毒30 min。切取大蒜發(fā)芽葉，接種到培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。每瓶接種5個(gè)發(fā)芽葉，每個(gè)處理10瓶，共設(shè)21個(gè)處理。培養(yǎng)條件為日溫25 ℃，夜溫20 ℃，光強(qiáng)1 500 lx，光照時(shí)間14 h·d-1，培養(yǎng)4周后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 愈傷組織的增殖及不定芽的分化 待出現(xiàn)愈傷組織后，每隔20～25 d繼代1次，選取繼代2次的愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)不定芽分化的MS培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊愈傷組織，每個(gè)處理5瓶，共設(shè)9個(gè)處理。4周以后觀察分化生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)不定芽分化數(shù)。

1.2.5 生根培養(yǎng) 將分化出不定芽后的綠苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基共設(shè)8個(gè)處理，2～3周后統(tǒng)計(jì)生根條數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜發(fā)芽葉愈傷組織類型

大蒜發(fā)芽葉接種28 d左右可以誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織大致有以下4種類型：白色雪花狀、質(zhì)地松散的愈傷組織（圖1-a）；半透明、呈漿糊狀的光滑型愈傷組織（圖1-b）；呈淺黃色瘤狀突起，質(zhì)地較致密的愈傷組織（圖1-c）；紅褐色、較致密的愈傷組織（圖1-d）。

本試驗(yàn)中，前3種類型的愈傷組織在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，出愈率較高，容易成活，而第4種紅褐色致密愈傷組織不發(fā)生分化，保持原狀或褐化死亡。

2.2 不同激素配比對(duì)誘導(dǎo)大蒜發(fā)芽葉愈傷組織的影響

2，4-D是人工合成的植物激素，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)，利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但不利于愈傷組織的增殖和分化。由表1可以看出，處理1～9中，2，4-D的濃度較低，形成愈傷組織緩慢且出愈率較低；處理12的出愈率最高，達(dá)到98%，當(dāng)2，4-D的濃度為3.0 mg·L-1時(shí) （16～21號(hào)培養(yǎng)基），愈傷組織形成個(gè)數(shù)稍有降低，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散易碎。

NAA和KT作為細(xì)胞分裂素，在大蒜發(fā)芽葉愈傷組織形成過(guò)程中也起著重要的作用，其不同的濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)具有一定的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中NAA濃度為2.0 mg·L-1，KT的濃度為1.0 mg·L-1時(shí)愈傷組織發(fā)生效果較好。何俊英等[9]以發(fā)芽葉為外植體，用2 mg·L-1 2，4-D和0.5 mg·L-1 KT誘導(dǎo)愈傷組織，出愈率30%左右；利用貯藏葉+發(fā)芽葉誘導(dǎo)愈傷組織，出愈率90%左右。本研究調(diào)整了愈傷組織誘導(dǎo)的激素配比，出愈率達(dá)到98%。因此，誘導(dǎo)大蒜發(fā)芽葉愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。

2.3 不同激素配比對(duì)發(fā)芽葉愈傷組織不定芽分化的影響

從表2可以看出，將繼代兩次生長(zhǎng)旺盛的致密愈傷組織轉(zhuǎn)入不同激素配比的分化培養(yǎng)基中，每隔1周觀察1次。愈傷組織誘導(dǎo)芽分化時(shí)有以下幾種情況：愈傷組織先分化出白色氣生根，再分化出不定芽（圖2-a）；愈傷組織塊兒上黃色的瘤狀突起從表面變綠，接著綠色的愈傷組織慢慢長(zhǎng)出叢生狀小芽，再?gòu)幕炕騻?cè)面分化出短而粗的根，最后小芽伸展長(zhǎng)成幼葉（圖2-b）；根與不定芽同時(shí)發(fā)生（圖2-c）；只分化出根，無(wú)不定芽分化（圖2-d）；極少數(shù)有玻璃化苗出現(xiàn)（圖2-e），而且葉細(xì)長(zhǎng)畸形，這可能是由于6-BA濃度過(guò)高而抑制不定芽分化形成的。

由表2還可以看出，植物激素濃度和種類對(duì)愈傷組織的分化生芽能力的影響是不同的。處理1、2、3中6-BA、NAA、KT濃度較低，芽的分化也最低，分化出的不定芽細(xì)弱；處理9中，生芽少，苗的玻璃化較嚴(yán)重，形成細(xì)絲狀根；處理4、5、6產(chǎn)生的芽健壯，而且生根較少；處理6不定芽平均個(gè)數(shù)最多，為6個(gè)。因此，誘導(dǎo)生芽的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1。

2.4 不同激素配比對(duì)試管苗生根的影響

從表3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中NAA的濃度為0.6 mg·L-1，KT濃度0.5 mg·L-1時(shí)，不定芽最早生根，生根數(shù)最多，平均生根條數(shù)為8.04，而且芽較長(zhǎng)、較粗，純白色。當(dāng)KT濃度一定時(shí)，較高和較低濃度的NAA均會(huì)抑制生根，表現(xiàn)為根少、纖細(xì)。可見(jiàn)，NAA在誘導(dǎo)生根時(shí)起主導(dǎo)作用，KT有利于根的橫向生長(zhǎng)，誘導(dǎo)出健壯的根。因此，誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為MS+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

3 討 論

在離體條件下，植物激素對(duì)大蒜發(fā)芽葉愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、不定芽的分化和試管苗的生根起著重要作用。其中2，4-D在發(fā)芽葉愈傷組織的誘導(dǎo)中起決定性作用，較高濃度的2，4-D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，并且能夠誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織。2，4-D 濃度過(guò)低或過(guò)高，愈傷組織出愈率均會(huì)下降。何俊英等[9]認(rèn)為，2，4-D濃度過(guò)低不能引起細(xì)胞脫分化，是由于進(jìn)入細(xì)胞后，立即遭到細(xì)胞內(nèi)酶的攻擊，使其部分或全部失活。2，4-D濃度過(guò)高，導(dǎo)致外植體各部分間發(fā)生同化產(chǎn)物重新分配，從而影響機(jī)體的淀粉、核酸、蛋白質(zhì)和酶等物質(zhì)發(fā)生變化。

較高濃度的2，4-D雖然有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，但不利于不定芽的分化。細(xì)胞分裂素BA、NAA等在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽中起關(guān)鍵作用。張素芝等[10]認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的細(xì)胞分裂素，有利于不定芽的分化。當(dāng)細(xì)胞分裂素的濃度過(guò)高時(shí)，雖然愈傷組織分化不定芽的能力增強(qiáng)，但容易發(fā)生玻璃化和形成畸形的毛狀根，不易成苗。細(xì)胞分裂素的濃度過(guò)低時(shí)，根比不定芽提前發(fā)生，且愈傷組織分化不定芽的能力顯著下降。培養(yǎng)基中加入適當(dāng)濃度的NAA和KT有利于生根。因此，植物激素的正確配比是大蒜離體培養(yǎng)的關(guān)鍵。

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