雞傳染性貧血病檢測方法研究進展

摘要：雞傳染性貧血?。–IA）是以再生障礙性貧血和全身淋巴組織萎縮為主要特征，以侵害雛雞為主要對象的免疫抑制性疾病。對該病毒的病原學、血清學、分子生物學及診斷方法等進行了綜述，以期對該病的研究與防控提供一定的參考。

關鍵詞：雞傳染性貧血病（CIA）；免疫抑制；檢測方法

中圖分類號：S831 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）01-0082-03

雞傳染性貧血病又稱雞出血性綜合征、貧血性皮炎綜合征、藍翅病，是由雞傳染性貧血病病毒（Chicken Infectious Anaemia Virus， CIAV）引起的以雛雞再生障礙性貧血和全身淋巴組織萎縮為主要特征的免疫抑制性疾病。Yuasa等[1]首次分離到該病毒后，德國、瑞典、英國等國家學者也相繼報道發(fā)現(xiàn)該病毒。1992 年，李孝欣等[2]首次在我國分離到該病毒，隨后通過對國內許多地區(qū)雞群進行CIA血清學調查和病毒分離鑒定，結果表明在我國許多地區(qū)普遍存在該病毒，一些雞場的陽性率高達40%～70%。該病的發(fā)病率一般在20%～60%，高時可達100% ，死亡率一般在5%～10% ，嚴重時可達60% 以上。該病主要導致雛雞再生障礙性貧血和免疫抑制，使雞群對其他病原的易感性增高和對某些疫苗的免疫應答能力下降，從而容易發(fā)生繼發(fā)感染和疫苗的免疫失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。

1 病原學方法

1.1 病血液學檢查

采集病雞的血液，加入檸檬酸鈉抗凝劑，取1 mL抗凝血加入紅細胞壓積管中，以3000 r/min 離心30 min 。紅細胞壓積值低于27% 且骨髓黃染的判為雞傳染性貧血病陽性。

1.2 電鏡觀察

CIAV 病毒粒子小，并且無論是感染易感動物還是接種于敏感細胞，獲得的病毒效價都比較低，因此直接進行電鏡觀察很難見到病毒粒子。直接電鏡觀察主要用于糞便、組織培養(yǎng)物中病毒的定性和新分離毒株的鑒定，也可通過純化細胞培養(yǎng)液中的病毒粒子，再經(jīng)過負染后進行電鏡觀察，病毒粒子呈球狀，直徑為23～25 nm ，二十面體對稱。免疫電鏡（IEM）觀察比直接電鏡觀察的敏感性更高，病毒是免疫復合物的聚集狀態(tài)，鏡下更容易找到病毒粒子[3-8]。

1.3 病毒分離鑒定

病毒分離培養(yǎng)是CIAV鑒定中最常用的方法之一，一般取感染7d的雞組織進行分離。CIAV在雞胚成纖維細胞、雞腎細胞、雞胚肝細胞等細胞上均不生長，但在馬立克氏病腫瘤細胞系MDCC-MSB1、MDCC-JP2、MDCC-RP1細胞上生長良好，目前普遍使用MDCC-MSB1傳代細胞做體外培養(yǎng)。其次，也可CIAV在雞的白血病病毒B淋巴細胞LSCC-1104/X5 B1、禽成骨髓細胞增生病病毒轉化的細胞系LSCC-HDII上增殖。但是一般需要6～8代培養(yǎng)才會出現(xiàn)細胞病變[7]

2 血清學方法

2.1 病毒中和試驗（VN）

NV試驗既可用SPF雞，又可用培養(yǎng)細胞進行，以SPF雞作中和試驗時，將血清5倍稀釋后在56℃滅活30min，與等體積2×103TCID50/mL的CAV混合后37℃作用1 h，接種5只1日齡SPF雞，每只0.1 mL，14 d后確定其感染性，3只及以上雞發(fā)病，則判為中和抗體陽性，1～2只雞發(fā)病判為疑似。

以培養(yǎng)細胞作中和試驗時，感染細胞以1∶5 繼代，需經(jīng)過7次繼代，根據(jù)繼代細胞是否死亡做出判定，血清抗體中和效價以稀釋倍數(shù)的倒數(shù)表示。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

Kurian等[9]建立了一種檢測CIAV血清抗體的重組抗原ELISA 檢測法，該法將澳洲株VP1 基因克隆到工程菌表達載體中，表達出的VP1融合蛋白可以成功地用于雞CIAV抗體的ELISA檢測[9]。ELISA是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。

2.3 間接免疫熒光抗體試驗（IFA）

MDCC-MSB1細胞培養(yǎng)收獲的病毒可作為細胞抗原檢測血清[10]。該抗原可與C IAV 陽性血清反應，用熒光標記的抗雞IgG 顯示，熒光顯微鏡下觀察，在腫脹的細胞核區(qū)出現(xiàn)較小的、形態(tài)不規(guī)則的熒光染色顆?；蜉啳h(huán)狀結構，可判為抗體陽性。但應設立嚴格的陽性血清、陰性血清和非CAV感染細胞作對照，以排除非特異性熒光和可能掩蓋特異性反應的背景染色。

3 分子生物學方法

3.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

CIAV基因組很小，且各個CIAV毒株的基因組序列很保守。因而設計診斷用的通用性PCR引物是可行的。許多研究者設計了特定的寡核苷酸引物，擴增出CIAV特異的核酸序列，特異性較高，敏感性也很好，這種方法被廣泛的應用。劉澤文等[11]建立了CIAV快速診斷的PCR方法。Oluwayelu等[12]運用PCR方法并結合限制性內切酶分析（RE），發(fā)現(xiàn)尼日利亞庭院飼養(yǎng)雞對CIAV易感，并且隱性帶毒。鄧顯文等[13]研制出CIAV-PCR檢測試劑盒，證明該試劑盒該試劑盒對CIAV臨床樣品的檢測具有特異、敏感、快速和準確的特點，適合在臨床生產(chǎn)中推廣使用。

3.2 競爭性P C R

劉澤文等[14]將刪除33個堿基序列的CIAV-DNA克隆進質粒pSBII，然后提取質粒DNA，經(jīng)過純化、定量后作為競爭性模板，建立了一種定量檢測雞傳染性貧血病毒核酸方法。該方法與傳統(tǒng)方法相比，具有節(jié)省時間、節(jié)約試劑和受其他因素干擾小等特點。

3.3 套式PCR（Nest-PCR）

用第一次PCR擴增區(qū)域內部的第二對（套式）引物對第一次PCR產(chǎn)物再次擴增，可以增加特異性和靈敏度。宋秀龍等[15]設計了兩對引物，建立了套式PCR技術，結果表明套式PCR可以檢測到10-7稀釋的組織樣品中的病毒DNA ，敏感性明顯高于一次性PCR，并且可以在大量背景DNA 中檢測到單拷貝CIAV。

3.4 實時熒光定量PC R（Real-time PC R）

Markowski 等[16]報道用Real-time PCR 對試驗感染的細胞中CIAV 進行了定量檢測，并證實其敏感性、特異性優(yōu)于套式PCR 。宋修慶等[17]根據(jù)雞貧血病毒（C IAV）的基因序列，選取一段高度保守的傳染性基因序列作為目的片段設計引物與探針，將該目的片段克隆到pMD18-T 載體中，作為陽性標準品。通過優(yōu)化熒光定量PCR 反應條件，建立了CIAV 的熒光定量PCR 檢測方法。操作簡單、快速，檢測線性范圍較寬，可達10～1010個 /μL 。

3.5 核酸探針法

利用脫氧核苷酸中堿基的配對性原則建立的一種檢測方法，選定病毒DNA 某段序列合成或克隆互補性探針序列，標記上同位素或生物素，當樣本中存在該段序列時，就會出現(xiàn)陽性結果。已知的CIAV 毒株基因型組為單個血清型，故探針可適用于各地區(qū)的CIAV 檢測。Noteborn 等[18]以非放射性的地高辛標記的CIAV 全基因組作探針進行斑點雜交，可成功檢測到CIAV 感染雞組織或感染的MSB1 細胞內的病毒核酸。

3.6 斑點雜交法

姜世金等[19]曾用斑點雜交法對山東省4個肉雞場和2個肉種雞場的雞中CIAV、MDV（馬立克病毒）、REV（網(wǎng)狀內皮增生病毒） 進行檢測，結果表明，除一個肉種雞場沒有檢測出REV以外，其他雞場均同時檢測出CIAV、MDV和REV。用斑點雜交法對病毒核酸進行檢測，能同時檢測多種病原，方便省時。該方法雖比PCR方法復雜，但其靈敏性有所提高。

3.7 環(huán)介導等溫擴增試驗（LAMP）

鄧顯文[20]等根據(jù)基因庫中CIAV的保守序列，設計了一套特異性LAMP引物，建立了CIAV的LAMP可視化檢測方法。該法敏感性可達10fg，高于常規(guī)PCR方法10倍，反應在l h內完成，通過肉眼觀察顏色直接判定結果。

4 小結與討論

CIAV的血液學檢查雖然方法簡單，但是容易出現(xiàn)錯誤判斷，需要試驗人員有較豐富的試驗經(jīng)驗，不適于廣泛使用；由于感染CIAV的動物中獲得的病毒效價都比較低，所以直接進行電鏡觀察很難見到病毒粒子；病毒分離雖然是診斷CIAV的有效手段，特異性強，但費時費力，不便推廣使用。VN試 驗既可用雛雞也可用細胞培養(yǎng)方法進行，該方法敏感性很高，但至少需2周才能完成；IFA試驗既可檢測CIAV抗原，又可檢測CIAV抗體，該方法符合率極高，使用較多。但是在檢測雞血清中低濃度的CIAV抗體方面，IFA試驗的敏感性不如VN試驗的敏感性高。ELISA方 法已經(jīng)建立了商品化的ELISA試 劑盒，該法敏感性高，特異性強，已被世界各國廣泛采用。一般而言，ELISA法比VN 試 驗和IFA試驗敏感，而且特異性與IFA試驗相一致。但是，該方法需要比較完備的試驗儀器和經(jīng)驗豐富的技術人員來操作和判斷結果，檢測一批樣品整個流程需要24h，對于基層獸醫(yī)站不適用。

PCR反應具有高度的特異性和敏感性，該技術已成為目前檢測禽類疫苗中CIAV污染的首選方法。然而模板DNA在提取過程中易污染，導致反應易出現(xiàn)假陽性結果。競爭性PCR這種方法特異性強敏感性高，較傳統(tǒng)的血清中和反應作定量檢測可大大節(jié)約時間和成本，因此該方法常用于分析病毒的定量和病毒在體內的分布等。Real-time PCR靈敏度高，可檢出10個/μL的病毒量，特異性強、結果穩(wěn)定，具有較好的應用前景。核酸探針法具有操作簡便、快速、特異性強和重復性好等優(yōu)點，但是它的靈敏度低于PCR方法，而且放射標記費用高，需要有特殊的儀器和藥品，且技術含量高，不適宜實驗室的日常診斷，很難在基層推廣應用。LAMP方法簡便、快速、靈敏、特異，不需要像PCR那樣進行凝膠電泳，可用于CIAV感染的快速檢測，適合在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場中進行。但是該方法引物設計要求比較高，在試驗過程中開蓋容易形成氣溶膠污染，加上目前國內大多數(shù)實驗室不能嚴格分區(qū)，假陽性問題比較嚴重。

聚合酶鏈式反應（PCR）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是實驗室最常用的CIAV的檢測方法，其操作簡單，靈敏度也比較高，比較適合廣泛使用。Real-time PCR、LAMP等方法是近年來比較新的診斷方法，特異性、靈敏度都有很大提高，但是大規(guī)模推廣還有待于進一步完善。由于雞傳染性貧血病目前尚無特異的治療方法，除了加強雞群的日常飼養(yǎng)管理，通常使用抗生素來減少繼發(fā)感染。

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