小鼠睪丸輸出管注射法建立轉基因小鼠的試驗研究

摘要：應用玻璃針將脂質體包裹的質粒pEGFP-C1通過睪丸輸出管注射到4周齡昆明（KM）小白鼠睪丸曲精細管內。共注射6只小鼠，其中一只注射后馬上做石蠟切片觀察轉染液注射入曲細精管內的情況，其他5只繼續飼養，1周后取1只小鼠培養睪丸的支持細胞，觀察是否有熒光出現。4周后，用PCR法檢測剩余4只小鼠睪丸組織曲細精管基因組中的外源DNA，4只都顯示為陽性。表明用睪丸輸出小管注射法將外源基因導入小鼠睪丸是一條簡便可行的新途徑。

關鍵詞：小鼠；轉基因；睪丸輸出管注射法

中圖分類號：S865.1文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.008

Construction of Transgenic Mice by Testicular Efferent Duct Injection

WANG He1，2， CAO Wen-guang2

（1. College of Animal Science， Xinjiang Agriculture University， Urumqi， Xinjiang 830052， China； 2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： Using glass needle plasmid pEGFP-C1 liposome-encapsulated was injected into the testicular efferent of 4 weeks male KM mice. Do immediately after an injection of paraffin sections to obserne the transfection solution was injected into the seminiferous tules， remanent mouse to continue to raise， after a week， take one mouse cultivating testicular sertoli cells. After four weeks， exogenous DNA in the PCR method for detecting the remaining four mouse testis seminiferous tubules genome， all as positive. The result indicated that the data in this study to transgenic animals could be established by testicular efferent injection.

Key words： mice；transgenic；testis efferent injection

轉基因動物在生命科學、醫學、生物制藥等領域有著廣泛的研究和應用前景， 因此，科學家們一直在探索一種更簡便易行、經濟實用而又高效的轉基因方法。有研究者應用曲細精管微注射法建立了轉基因動物[1-4]，該方法只需注射、交配、檢測3個步驟，簡便易行。精原干細胞的移植首先由Brinstre等[5]報道，他們先將可育小鼠的混合生精細胞移入不育小鼠的曲細精管，結果在受體睪丸內產生了具有受精能力的精子。目前，利用雄性動物生殖細胞建立轉基因動物的方法成為許多科學家關注的對象。將攜帶外源基因的轉染液注射到睪丸曲細精管中[6]，體內直接轉染生殖細胞，產生轉基因精子，通過動物自然交配最終獲得轉基因動物。這種體內轉染的方法簡單，易于操作，產生轉基因動物周期短，制備環節少。就目前而言，最大的優點是成功避開了體外培養生殖干細胞的困難。本試驗用顯微注射針將脂質體包裹的質粒載體pEGFP-C1，通過睪丸的輸出小管注射到KM白小鼠的曲細精管中，成功將外源基因導入睪丸組織，旨在探索一條新的、簡單可行的建立轉基因動物的途徑。

1材料和方法

1.1材 料

1.1.1試驗動物清潔級40日齡雄性KM小鼠6只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2主要試劑質粒pEGFP-C1（本實驗室留存）。質粒提取試劑盒購于美國Promega公司。脂質體lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。臺盼藍、DMEM培養基、Opti-MEN培養基購自Gibco公司。引物合成由上海生工生物工程公司完成。動物組織DNA基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。其它試劑均為國產分析純。

1.1.3試驗器材體視解剖鏡，玻璃管（100×0.1 mm），酒精燈，打火機，1 mL的注射器，手術器械（用前需消毒），臺盼藍（0.4%），生理鹽水稀釋的戊巴比妥納（注射時濃度一般為1%）。

1.2方 法

1.2.1質粒的轉化提取pEGFP-C1轉化入空白感受態菌種，鋪板并用卡那霉素篩選后，挑取陽性克隆，大量培養，用Promega質粒提取試劑盒提取質粒，過濾除菌分裝后，置-20 ℃備用。

1.2.2注射用玻璃針的制作將玻璃管用酒精燈灼燒的辦法拉成玻璃針，將針尖打磨成30°的斜面。一小段橡膠管一頭連接注射器，一頭連接拉好的玻璃針，準備注射使用。

1.2.3轉染液的配制按脂質體試劑Lipofectamine2000說明書，把載體pEGFP-C1與脂質體混合。具體操作過程如下，轉染液A制備：將4 μg質粒加到100 μL無菌、無血清的Opti-MEM培養液中，并輕輕混勻。轉染液B制備：將10 μL脂質體Lipofectamine2000 與100 μL無菌、無血清的Opti-MEM培養液混勻，室溫放置5 min。隨后將A液與B液混合，37 ℃孵育20 min，最后加入2 μL 4%臺盼藍混勻，即可用于注射。

1.2.4睪丸輸出小管的注射麻醉小鼠，注射時濃度一般為1%，腹腔注射。小鼠昏迷后，固定四肢于木板上，置于體視顯微鏡下。開腹：逐層打開腹腔，表皮至肌層。將睪丸拉出腹腔：于膀胱旁邊尋找與睪丸相連的脂肪墊，輕輕拖出腹腔，小鼠的睪丸和附睪順勢被拖出腹腔。調節光源的亮度及顯微鏡放大倍數。用尖頭鑷找出輸出小管（圖1），并調整木板角度，使小鼠輸出小管的方向大約與玻璃針方向平行。雙手操作，夾起輸出小管，將其中一段套入玻璃針頭部，并順勢平行將輸出管向玻璃針方向移動。左手固定輸出小管位置，右手推動注射器，將轉染液和臺盼藍的混合液慢慢注射進輸出小管內。然后看到藍色的液體順著曲精細管的走向慢慢的充滿大部分曲精細管，使睪丸表面大部分曲精細管變藍。注射結束后，將睪丸放回腹腔，逐層關腹，縫合。最后將碘酒棉敷于小鼠腹部防止感染。注射后小鼠單獨飼養。

1.2.5睪丸組織的石蠟切片 小鼠注射后，立即取一只小鼠將其睪丸做石蠟切片處理，觀察轉染液在曲細精管內的分布情況，按文獻[7]里組織石蠟切片的方法進行。

1.2.6睪丸支持細胞的分離培養小鼠注射單獨飼養1周后，取一只小鼠的睪丸進行睪丸支持細胞的分離培養，觀察是否有熒光產生。按文獻[8]的方法進行。

1.2.7睪丸組織曲細精管DNA提取注射后小鼠單籠飼養4周后提取剩余4只小鼠睪丸組織曲細精管DNA，按提取試劑盒說明書進行。

1.2.8轉基因仔鼠的檢測利用Primer5軟件設計EGFP上、下游引物。上游引物序列為：5’-CAGCAGTCTTCCAACCCAAT-3’，下游引物序列為5’-TGAGAGGCGCACAGAACATC -3 '。PCR 產物為314 bp。PCR反應體系包括：Taq DNA Polyrases （ 5 U·μL-1） 0.5 μL、10×Buffer 5 μL、dNTP（ 各2.5 mmol·L-1） 4 μl、引物Ⅰ、Ⅱ（ 25 pmol·μL-1）各1 μL、pEGFP-C1（ 500～1000 ng·μL-1） 1 μL 、dd H2O 37.5 μL。PCR 反應條件為94 ℃預變性5 min后，進入循環，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33個循環，72 ℃延伸10 min。1.0%的瓊脂糖凝膠電泳。

2結果與分析

2.1睪丸輸出管注射后轉染液在睪丸內的情況

轉染液在曲細精管中的流動規律及分布：注射前期睪丸內壓相對較小，只需輕微用力便可使轉染液迅速地在曲細精管中流動（圖2）。注射后期由于睪丸內壓變大，盡管加大注射壓力，但轉染液在曲細精管中的流動速度沒有太大變化。此時停止注射，一個睪丸大約需要注射80～100 μL轉染液，時間大約10～20 min。通過睪丸輸出管，可以使小鼠睪丸表面大約70%～80%的曲細精管充滿轉染液（圖3），并且離睪丸輸出管近的曲精細管轉染液的充盈程度明顯較遠端高。

2.2睪丸組織石蠟切片觀察

睪丸組織經石蠟切片后，在顯微鏡下觀察，曲細精管內部完全被轉染液染為藍色（圖4），這表明轉染液已經完全進入曲細精管管腔內，這樣就大大提高了pEGFP-C1整合到精原細胞的效率。

2.3睪丸支持細胞的分離培養

支持細胞分離培養24 h后，在顯微鏡下觀察發現有發出綠色熒光的細胞（圖5、圖6），這表明pEGFP-C1已經整合到睪丸支持細胞內。

2.4 睪丸曲細精管的PCR鑒定

利用設計的引物，對4只睪丸曲細精管進行PCR鑒定，都是PCR陽性（圖7）。

3結論與討論

本試驗采取的睪丸輸出小管注射法，除此方法外，目前報道的還有睪丸網注射法[9]。Ogawa等[10]報道了此兩種移植方法具有相似的移植效率， 各有優缺點。睪丸網注射法不需要解剖游離輸出小管[11]，但是直接睪丸網注射會由于這些纖維結締組織的彈性， 加之睪丸網厚度不到0.2 mm， 很容易穿透睪丸網而導致細胞懸液滲漏到間質， 而且一旦穿破則很難補救[12]。經輸出小管注射的方式具有快速可靠、滲漏少的特點。

小鼠睪丸輸出小管處在睪丸血管蒂的一側，幾乎與睪丸血管蒂大動脈平行，一端與睪丸相連，另一端與附睪聯系。在進行睪丸輸出管注射時，應將玻璃針的針尖與輸出管平行，針尖與輸出管的角度≤10°，針頭一旦插入輸出小管應始終保持插入針的平衡，如不小心將注射針從輸出小管中脫出，要重新剝離一段輸出管再進行注射。精原細胞通過分裂、生長和發育最后成為初級精母細胞。然后初級精母細胞經過兩次成熟分裂，變為次級精母細胞和精子細胞[13]。精子細胞再經過一些形態變化，最后變為精子。精子由精原干細胞成熟分化而來，精原干細胞在雄性動物出生后，一直處于不斷分裂增殖的狀態[14]。將外源基因轉染到曲細精管內的精原干細胞，使其整合到精原干細胞的染色體中，這樣，就有可能使干細胞不斷分化成熟的精子攜帶外源基因[15]。另外，小鼠睪丸支持細胞是曲細精管的上皮細胞，給精子的發生提供微環境，在精子發生中起重要的作用。本試驗采用睪丸輸出管注射法將脂質體包裹pEGFP-C1表達載體注射到曲細精管中，石蠟切片觀察到轉染液已經完全進入曲細精管內，這樣便大大提高了外源基因整合到曲細精管的效率。又經一周后分離培養睪丸的支持細胞，發現睪丸的支持細胞有綠色熒光產生，說明外源基因已經整合到睪丸的支持細胞內，而支持細胞對精子的發生具有重要的作用，這樣便會源源不斷地產生帶有外源基因的精子，從而達到轉基因的目的。后對其余4只小鼠的睪丸做了PCR檢測，均顯示為陽性，說明這幾只小鼠已經構建成為轉基因小鼠。

本試驗采用睪丸輸出管注射法將外源基因導入曲細精管中，而不是睪丸直接注射[16]或者打點注射[17]，通過一個體內的轉基因過程使得精子攜帶外源基因，獲得轉基因小鼠。過程簡單，對于試驗條件的要求相對低。更重要的是一旦精原細胞成功整合了外源基因，由于其自身的獨特生物學性質，睪丸中便會源源不斷地產生大量轉基因精子。試驗對于大的家畜等動物建立轉基因模型具有重要的指導意義。

參考文獻：

[1] Kubota H， Avarbock M R， Brinster R L. Growth factors essential for self-renewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells[J]. PNAS，2004， 101（47）： 16489-16494.

[2] Ikawa M， Tergaonkar V， Ogura A， et al. Restoration of spermatogenesis by lentiviral gene transfer： Offspring from infertile mice[J]. PNAS， 2002， 99（11）： 7524-7529.

[3] Kanatsu-Shinohara M，Ogonuki N， Inoue K， et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells[J]. Biology of Reproduction， 2003，69：612-616.

[4] Huang Y， Tamura M， Sakurai T， et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluores cent protein gene[J]. Federation of European Bichemical Societies， 2000，487（2）： 248-251.

[5] Brinster R L， Avarbock M R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation[J]. Proceedings National Academy of Sciences USA， 1994，91：303-307.

[6] 謝暢，于明舉，惠楠，等.通過睪丸內注射轉染外源DNA在小鼠精子的表達[J].動物學雜志，2010，45（2）：151-157.

[7] 竇紅偉，趙興緒，馬月輝，等.綿羊精原干細胞移植受體內源性生殖細胞的消除研究[J].貴州農業科學，2009，37（3）：97-100.

[8] 楊君杰，劉善榮，楊玲，等. 小鼠睪丸支持細胞的分離培養與鑒定[J]. 第二軍醫大學學報，2006，27（7）：741-744.

[9] 丁曉麟，張寒瑩，許欣，等. 睪丸網注射法建立轉基因小鼠[J]. 中國男科學雜志，2008，22（7）：5-8.

[10] Ogawa T， Arechaga J M， Avarbock M R， et al.Transplantation of testis germinal cells into mouse semin ferous tubules[J]. Int J Dev Biol，1997，41（1）：111-122.

[11] 沈新明，喬貴林，張玲，等. 用曲細精管微注射法建立綠色熒光蛋白轉基因小鼠[J]. 第一軍醫大學學報，2002，22（3）：250-253.

[12] 申復進，張茨，王將，等.輸出小管-睪丸網注射提高小鼠精原干細胞移植效率[J].武漢大學學報：醫學版，2009，30（4）：518-521.

[13] Johnston D S， Russell L D，Griswold M D. Advances in spermatogonial stem cell transplantation[J]. Reviews of Reprodution， 2000（5）：183-188.

[14] Mclean D J， Friel P J， Johnston D S， et al. Characterization of spermatogonial stem cell maturation and differentiation in neonatal mice[J]. Biology of Reproduction. 2003，69：2085-2091.

[15] Kim J H， Jung-Ha H S， Lee H T， et al. Development of a positive method for male stem cell-mediated gene transfer in mouse and pig[J]. Molecular Reproduction and Development，1997， 46：515-526.

[16] 袁進，安靚，顧為望，等.睪丸內注射和體內電穿孔法建立轉基因小鼠的實驗研究[J].南方醫科大學學報，2007（2）：168-171.

[17] 宋天增，馮靜，曾憲垠，等. 用注射器直接對睪丸打點注射EGFP生產轉基因兔的試驗研究[J].家畜生態學報， 2010，33（3）：19-23.