適合工業(yè)化生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體發(fā)酵條件的優(yōu)化

摘 要：為了優(yōu)化適合工業(yè)化生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體的發(fā)酵條件，以菌絲體干質(zhì)量或總多糖含量為篩選指標(biāo)，采用搖瓶培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)方法，通過正交試驗對發(fā)酵配方中的N、C源，發(fā)酵過程中的接種量、接種時間進(jìn)行了優(yōu)化，同時，對通氣量條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，適合工業(yè)化生產(chǎn)蛹蟲草菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖20 g·L-1、大豆蛋白粉8 g·L-1。發(fā)酵條件為：接種量5%、通氣量1∶0.4（V/V·min）、發(fā)酵時間108 h。在上述條件下獲得的發(fā)酵液菌絲體含量達(dá)到了17.16 g·L-1，總多糖含量達(dá)到1 073.82 mg·L-1。

關(guān)鍵詞：工業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)酵條件；正交試驗；發(fā)酵罐；發(fā)酵放大

中圖分類號：Q815 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.04.004

Suitable Optimization of the Industrial Production Fermentation Condition of Cordyceps militaris Aycelium

HOU Jin-xin， DUAN Shuo-nan， WANG Li-an

（College of life Science， Hebei Normal University， Shijiazhuang， Hebei 050081， China）

Abstract： To optimize the fermentation conditions of Cordyceps militaris mycelium which was suitable for industrial production. Using the method of shake-flask culture，culture in fermenter and Orthogonal test to optimize the fermentation parameter of the carbon source ，nitrogen source， inoculum size of fermentation and Incubation time by mycelium dry weight and total polysaccharide content of cordyceps militaris mycelium. Meanwhile， the conditions of aeration amount were screened. The results shaced that the suitable optimized medium for industrial production of cordyceps militaris mycelium fermentation was glucose 20 g·L-1， soy protein powder 8 g·L-1. Fermentation conditions were as follows： 5% of the inoculum size， aeration rate of 1：0.4 （V/V·min），Incubation time of 108 h. Under the above conditions， whtch yield of mycelium content reached 17.16 g·L-1， the total polysaccharide content reached 1 073.82 mg·L-1 in the fermentation broth.

Key words： industrial production； fermentation conditions； orthogonal test； fermenter； fermentation amplification

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北蟲草，是一種具有很高營養(yǎng)價值的食、藥用真菌，其含有蟲草素、蟲草多糖等多種天然活性成分[1]。具有很好的抗氧化、抗衰老、清肺、益腎、抗癌等多種功效，與冬蟲夏草藥效相當(dāng)，是冬蟲夏草良好的替代品[2-6]。但是，由于人工培養(yǎng)的蟲草子實體生長周期漫長，培養(yǎng)條件復(fù)雜，不能滿足國內(nèi)外市場的需要[7]。隨著液體發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，通過液體發(fā)酵法培養(yǎng)真菌的技術(shù)逐漸成熟，目前對蛹蟲草液體發(fā)酵研究的報道較多[8-12]，且發(fā)酵多采用合成培養(yǎng)基[13-14]或者成本較高的天然培養(yǎng)基[12]，對于蛹蟲草工業(yè)化生產(chǎn)條件的探索尚未報道。本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)蛹蟲草液體發(fā)酵條件并在最適條件下進(jìn)行發(fā)酵的放大，從0.5 L的三角瓶放大到100 L的發(fā)酵罐，以期為蛹蟲草發(fā)酵液的進(jìn)一步生產(chǎn)提供借鑒參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 蛹蟲草由河北師范大學(xué)生化與分子生物學(xué)實驗室保藏。

1.1.2 試劑 大豆蛋白粉（soy protein powder，SPP食品級）：鎮(zhèn)江市尚谷食品有限公司提供；馬鈴薯：市售；葡萄糖（分析純）：天津市百世化工有限公司；瓊脂粉（分析純）：北京Solarbio公司；濃硫酸（分析純）：石家莊市試劑廠。

1.1.3 儀器設(shè)備 ZHQ-100型100 L氣升式發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江中恒生物工程設(shè)備有限公司；QL-901型漩渦混合器：江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠；ZHWY-2102型恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造有限公司；756MC紫外可見分光光度計：上海菁華科技有限公司；ALPHA I-6型真空冷凍干燥機(jī)：西德CHRIST公司；GRX12型干熱消毒箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；B-260型恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；AvantiTM J-25 I型離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司；FA1104型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)酵液中菌絲干質(zhì)量測定 準(zhǔn)確量取100 mL發(fā)酵液，6 000 r·min-1離心10 min，取沉淀置于100 ℃烘箱內(nèi)直至質(zhì)量不再改變?yōu)橹梗Q取菌絲質(zhì)量。

1.2.2 發(fā)酵液中總粗多糖檢測 發(fā)酵液處理：發(fā)酵液經(jīng)膠體磨和高壓均質(zhì)機(jī)處理后，準(zhǔn)確量取50 mL于250 mL三角瓶中，再加入50 mL蒸餾水，常溫超聲水浴20 min，然后80 ℃水浴浸提4 h，抽濾，濾液定容至100 mL，Sevage法[15]除蛋白。精確吸取10 mL去蛋白后的濾液。加4倍體積的95% 乙醇，搖勻，4 ℃過夜，抽濾后，將沉淀用蒸餾水溶解，定容至100 mL，苯酚-硫酸法檢測[16]。

1.2.3 培養(yǎng)基原種培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；一級液體種子培養(yǎng)基：液體PDA培養(yǎng)基。

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗

（1）葡萄糖和大豆蛋白粉添加量試驗。培養(yǎng)條件：大豆蛋白粉4 g·L-1，葡萄糖按表1添加，接種量5%，搖床175 r·min-1恒溫25 ℃培養(yǎng)5 d。大豆蛋白粉按表1添加，葡萄糖20 g·L-1，接種量5%，搖床175 r·min-1恒溫25 ℃培養(yǎng)5 d。每個梯度做3個重復(fù)。

（2）接種量和培養(yǎng)時間試驗。培養(yǎng)條件：大豆蛋白粉4 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，接種量見表2，搖床175 r·min-1恒溫25 ℃培養(yǎng)5 d。大豆蛋白粉4 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，接種量5%，培養(yǎng)時間按表2進(jìn)行，搖床175 r·min-1恒溫25 ℃培養(yǎng)。每個梯度做3個重復(fù)。

1.2.5 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)定L9（34）正交試驗。

1.2.6 發(fā)酵過程的放大過程中通氣量的控制 經(jīng)過正交試驗得出的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行100 L氣升式發(fā)酵罐上罐發(fā)酵。裝料系數(shù)0.7，發(fā)酵溫度25 ℃，通氣量分別控制為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8（V/ V·min ），SPP、葡萄糖添加量、接種量按正交試驗結(jié)果進(jìn)行添加，pH值自然。每隔12 h取樣，對發(fā)酵液品質(zhì)進(jìn)行檢測，同時檢測菌絲干質(zhì)量和發(fā)酵液中胞外粗多糖的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

圖1 A結(jié)果顯示了不同的葡萄糖濃度發(fā)酵后菌絲干質(zhì)量不同，葡萄糖濃度在5～20 g·L-1區(qū)間變化時，菌絲干質(zhì)量隨著葡萄糖的濃度增加而增加，葡萄糖為25 g·L-1時菌絲干質(zhì)量稍微有所下降，可能是滲透壓過大不適于蛹蟲草菌絲的生長。在葡萄糖濃度為20 g·L-1時，菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大值，為10.77 g·L-1。所以，取葡萄糖為10，15，20 g·L-1 3個濃度梯度進(jìn)一步進(jìn)行正交試驗。

圖1 B結(jié)果顯示了在不同SPP濃度下菌絲干質(zhì)量的變化情況。隨著 SPP濃度的增加，菌絲干質(zhì)量也逐步增加，SPP濃度在2～8 g·L-1時菌絲干質(zhì)量增加較明顯，SPP濃度在8～10 g·L-1時菌絲增加量為0.08 g。綜合結(jié)果和發(fā)酵成本取SPP濃度為4，6，8 g·L-1 3個濃度梯度進(jìn)行正交試驗。

圖1 C結(jié)果顯示了3種菌種在不同的接種量時，菌絲體干質(zhì)量的變化。接種量的增加，對蛹蟲草菌絲體干質(zhì)量的影響不大。綜合試驗結(jié)果和發(fā)酵成本取5%，7%，9% 3個接種量梯度進(jìn)行正交試驗。

圖1 D 結(jié)果顯示了隨著發(fā)酵時間的延長菌絲體干質(zhì)量逐步增加，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到132 h時，菌絲體干質(zhì)量達(dá)到最大值，為12.18 g·L-1。隨著時間的繼續(xù)延長，菌絲體干質(zhì)量微有波動，說明發(fā)酵到達(dá)了穩(wěn)定期。發(fā)酵時間的延長會增加發(fā)酵的成本，綜合試驗結(jié)果和發(fā)酵成本取84，108，132 h 3個時間梯度進(jìn)行正交試驗。

2.2 蛹蟲草發(fā)酵條件正交試驗結(jié)果

正交試驗經(jīng)極差分析（表4）， 結(jié)果顯示4個因素影響效果為：A>B>D>C。因此，蛹蟲草最佳發(fā)酵工藝條件為：A3B3D1C3，即：葡萄糖20 g·L-1、大豆蛋白粉 8 g·L-1、接種量5%、發(fā)酵時間108 h。

由方差分析方法得知（表5），葡萄糖含量A和大豆蛋白粉含量B對菌絲體干質(zhì)量影響較大，接種量D次之，培養(yǎng)時間C影響最小。經(jīng)兩兩比較得到最佳培養(yǎng)條件為：A3B3D1C3即：葡萄糖20 g·L-1、大豆蛋白粉 8 g·L-1、接種量5%、發(fā)酵時間108 h。

2.3 在最佳條件下進(jìn)行初步發(fā)酵放大

從圖2 A中我們可以看出，當(dāng)通氣量在1∶0.2（V/ V·min）時菌體體生長緩慢，說明此條件下提供的氧氣不足，不能使菌絲體正常生長。當(dāng)通氣量增大到1∶0.4（V/ V·min）以上時，菌絲體能正常生長。圖2 B結(jié)果顯示，當(dāng)通氣量在1∶0.4（V/ V·min）時發(fā)酵液中總粗多糖含量最高，說明通氣量過高或者過低都不利于多糖的形成。

3 結(jié)論與討論

通過單因素和正交試驗確定了蛹蟲草最佳工業(yè)發(fā)酵條件為：葡萄糖20 g·L-1、大豆蛋白粉 8 g·L-1、接種量5%、發(fā)酵時間108 h，在此條件下得到蛹蟲草菌絲干質(zhì)量為：17.16 g·L-1，粗多糖含量高達(dá)1 073.82 mg·L-1，這不僅比柴建萍等[10]的16.24 g·L-1略高，而且培養(yǎng)條件大大節(jié)約了成本，原材料處理更加方便，添加劑得到了進(jìn)一步控制，使用氣升式發(fā)酵罐節(jié)約了能源。

在小試放大過程中，控制通氣量的變化不僅能影響菌絲體的生長，也能影響蛹蟲草多糖的合成。結(jié)果中顯示，當(dāng)通氣量過小時不利于菌絲體的生長，當(dāng)通氣量增加到1∶0.4（V/V·min）以上時菌絲體能夠正常生長但對菌絲體總量的增加影響不大。通氣量過大不利于多糖的合成，可能是過多的氧氣和鼓泡運動造成了細(xì)胞的呼吸作用增強(qiáng)，糖流向于代謝方面更多。因此，在發(fā)酵放大過程中將通氣量控制在1∶0.4（V/V·min）最合適。

發(fā)酵原料均為天然材料無添加劑，發(fā)酵液質(zhì)量便于控制，有利于發(fā)酵液進(jìn)一步開發(fā)利用。

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