缺血后處理激活自噬保護(hù)皮瓣機(jī)制研究

[摘要]目的：缺血后處理皮瓣在臨床上已經(jīng)運(yùn)用，開始相關(guān)研究探究缺血后處理對(duì)皮瓣保護(hù)機(jī)制。方法：健康成年新西蘭大白兔，分為3組。A組為給予缺血后處理；B組為再灌注前5min給予自噬阻滯劑3-甲基腺嘌呤 10μl +缺血后處理。C組，直接應(yīng)用微血管夾阻斷腹壁淺血管持續(xù)缺。6h后再灌。各組分別進(jìn)行自噬指標(biāo)Beclin1、LC3 免疫組化和皮瓣存活率檢測(cè)。結(jié)果：新西蘭大白兔完全存活。B、C組相比較，自噬Beclin1、LC3 免疫組化染色陽性細(xì)胞面積變化未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P>0.005）。實(shí)驗(yàn)組皮瓣存活面積比較， B 與C相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.005），但是A與B、C相比較，上述指標(biāo)兩兩之間都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差別（P<0.005）。結(jié)論：缺血后處理對(duì)皮瓣再灌注損傷有保護(hù)作用，該作用可能和自噬激活有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]皮瓣；缺血-再灌注損傷；自噬

[中圖分類號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）02-0261-03

近年， 缺血再灌注損傷的防治逐漸成為眾多學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。自2004年zhao 等學(xué)者提出了缺血后處理概念， 并且通過一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)后處理具有心肌，肌肉等保護(hù)作用[1]。內(nèi)皮細(xì)胞是皮瓣再灌注損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。缺血后處理和血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)有關(guān)[2]。最近研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷中激活自噬有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的作用[3]。缺血后處理保護(hù)皮瓣作用是否和激活自噬有關(guān)，筆者將進(jìn)行相關(guān)研究 以論證該假說。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型的建立：選用健康成年新西蘭大白兔24只， 雌雄不限， 體重2.5～3.5kg。以3%異戊巴比妥鈉（1ml/kg）耳緣靜脈注射，麻醉后以仰臥位固定，全腹部備皮后制取左側(cè)腹股溝皮瓣約4cm×8cm，以腹壁淺血管為蒂，保留血管蒂。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與分組：24只大白兔模型建立后， 用隨機(jī)數(shù)字表法平均分成3組，每組8只。對(duì)照組為C組，誘導(dǎo)再灌注損傷時(shí)首先微血管夾阻斷腹壁淺血管缺血6h恢復(fù)正常血供；實(shí)驗(yàn)組持續(xù)缺血再灌注后按照前期的研究設(shè)定給予短暫缺血再灌注處理（10s缺血+10s再灌注為一個(gè)療程，共6個(gè)療程，持續(xù)2min）。按照自噬抑制劑使用的方式繼續(xù)分為2組：A組為給予缺血后處理；B組為再灌注前5min給予腹壁淺靜脈給予自噬抑制劑3一甲基腺嘌呤10μl缺血后處理。A，B組處理后實(shí)驗(yàn)步驟與對(duì)照組相同。在圍實(shí)驗(yàn)期血管蒂注意保溫防止痙攣。

1.3標(biāo)本收集與檢測(cè)：每組兔子恢復(fù)血流4h后， 取2只處死，甲醛固定皮瓣組織后HE染色下觀察下觀察。Abgent 公司的兔抗人微管相關(guān)蛋白輕鏈3（MAP1- LC3）多克隆抗體 ，Santa Cruz 公司的兔抗人自噬基因Beclin1 多克隆抗體。福建邁新生物制品公司的辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔二抗體， DAB 顯色。PBS 緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照。以細(xì)胞胞漿棕黃染為陽性；顯微數(shù)字圖像分析系統(tǒng)采集、分析免疫組化結(jié)果。

其余6 只動(dòng)物于術(shù)后1周判斷皮瓣成活情況，計(jì)算皮瓣成活面積的百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：SPSS11.0行統(tǒng)計(jì)處理， 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 大體觀察：手術(shù)中和手術(shù)后1周內(nèi)所有的新西蘭大白兔均存活。皮瓣恢復(fù)灌注24h內(nèi)， C組皮瓣遠(yuǎn)端大部分組織迅速腫脹淤紫，指壓毛細(xì)血管反應(yīng)消失，以后皮瓣兩邊逐漸發(fā)黑。術(shù)后7天壞死界限明確。A實(shí)驗(yàn)組皮瓣兩側(cè)邊緣部分出現(xiàn)腫脹，色澤偏暗，指壓毛細(xì)血管回流稍遲緩，一周后兩側(cè)皮瓣邊緣部分失活。B，C組肉眼觀察形態(tài)變化接近。

2.2皮瓣Beclin1、LC3免疫組化染色陽性細(xì)胞比較：B、C組相比較，Beclin1及LC3免疫組化染色陽性面積也未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（P>0.05）。但是A與B、C相比較，兩兩之間都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差別（P<0.05）（見圖1）。

2.3皮瓣存活面積：實(shí)驗(yàn)組A和B 與C相比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），皮瓣存活面積提高了2倍左右。但是B和C組相比較，成活面積雖然稍有提高，但是差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表1）。

3 討論

目前缺血后恢復(fù)灌注對(duì)皮瓣的危害越來越引起重視，再灌注后皮瓣損傷除了沒有恢復(fù)以外，反而呈現(xiàn)進(jìn)行性加重。但是缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚。自由基損傷常被看成缺血一再灌注損傷的主要原因之一，但抗自由基治療的效果不理想。細(xì)胞凋亡也被認(rèn)為是引起缺血再灌注損傷的一個(gè)重要原因[4]。如何預(yù)防和減輕組織缺血再灌注損傷，防止凋亡是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。

缺血后處理是通過一次或多次短暫缺血，再灌注過程而減輕組織再灌注損傷的發(fā)生的新的機(jī)械性干預(yù)措施，應(yīng)用于再灌注早期。具有可預(yù)知性和可控制性的特點(diǎn)， 而且臨床應(yīng)用簡(jiǎn)單、方便、可行， 易為外科醫(yī)生所接受。雖然缺血后處理已在皮瓣中應(yīng)用[5-7]，但其保護(hù)機(jī)制仍然不明確。

自噬是一種存在于正常細(xì)胞和病態(tài)細(xì)胞中非選擇性的降解機(jī)制， 其活化通常發(fā)生在應(yīng)激狀態(tài)下， 有兩個(gè)主要作用：①在營(yíng)養(yǎng)缺乏的情況下為細(xì)胞生長(zhǎng)代謝提供必要的大分子物質(zhì)和能量；②清除細(xì)胞內(nèi)過?；蛴腥毕莸募?xì)胞器。自噬發(fā)生早于凋亡[9-10]。自噬對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用11。由此筆者設(shè)想自噬激活可能是缺血后處理保護(hù)皮瓣的重要機(jī)制。

筆者的研究著重探討缺血后處理對(duì)新西蘭大白兔腹股溝皮瓣再灌注損傷的影響并且研究自噬在缺血后處理保護(hù)皮瓣機(jī)制中作用，并通過對(duì)分組處理皮瓣進(jìn)行大體觀察，術(shù)后7天測(cè)量皮瓣面積，研究相關(guān)的自噬指標(biāo)變化。抑制細(xì)胞自噬可以抵消皮瓣的缺血后保護(hù)作用。結(jié)果證實(shí)了缺血后保護(hù)機(jī)制的激活，預(yù)防皮瓣再灌注損傷和自噬有關(guān)。但缺血后處理調(diào)節(jié)自噬的具體機(jī)制還不明確。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步探討缺血后保護(hù)游離皮瓣激活自噬有效途徑，研究自噬和細(xì)胞凋亡互相影響的機(jī)制關(guān)系。

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[收稿日期]2012-11-10 [修回日期]2013-01-25

編輯/張惠娟