TMV溶液誘導蠶豆根尖微核的研究

摘要： 應用蠶豆根尖微核試驗初步研究了一定濃度的煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV） 溶液對環境污染的效應。結果表明，TMV溶液濃度與各處理蠶豆根尖微核率的相關性較強（r=0.982），且差異極顯著 （P=0.003<0.01），即蠶豆根尖微核率隨著TMV溶液濃度的升高而增加；同一濃度的TMV溶液處理蠶豆根尖不同時間后其微核率在各組間沒有顯著差異（P>0.01），且蠶豆根尖微核率與處理時間相關性不強（r=0.312）。研究表明蠶豆根尖細胞微核技術可應用于煙草花葉病毒遺傳毒性監測。

關鍵詞：煙草花葉病毒（TMV）；蠶豆根尖；微核率

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0561-03

存在于水體中的植物病毒可能導致植物病毒病流行，給農業生產帶來不良影響。目前很難估計水體中植物病毒對農業生產的潛在威脅程度，但煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV） 通過植物根侵染植物已得到證實。曾嶸等[1]研究發現在烤煙漂浮育苗中，TMV可以通過營養液侵染煙苗發病；劉勇等[2]研究表明水窖水體中的TMV具有侵染力。已有從水體中分離到煙草花葉病毒的報道[3-9]，水體中存在的TMV有可能對環境造成一定的污染。

環境污染物（如物理、化學、生物污染源）能誘發植物細胞的染色體畸變，染色體斷片游離在細胞質中于分裂末期形成微核。蠶豆根尖細胞微核試驗（Micronucleus test，MCNT） 是以蠶豆根尖細胞微核出現的頻率為測試終點的監測方法[10]。目前對水體植物病毒污染及其環境效應的研究極少，本研究以不同濃度的TMV溶液處理蠶豆根尖，分別統計各處理的蠶豆根尖微核率以及相應的污染指數，旨在初步探討一定濃度的TMV溶液對環境污染的潛在威脅。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蠶豆為青皮蠶豆（本地種），供試病毒為煙草花葉病毒的普通株系。

1.2 方法

1.2.1 供試病毒液的制備 將純化的TMV接種于普通煙株K326（Nicotiana tabacum cv. K326），3周后采病葉提純TMV病毒[11]，經紫外掃描測得其濃度為109.9 μg/mL[12]，并將其稀釋，配成濃度分別為2.7、5.4、8.1、10.8和13.5 μg/mL的病毒液各10 mL，4 ℃保存備用。

1.2.2 蠶豆根尖的制備 選取顆粒飽滿、大小均勻的青皮蠶豆，用10%的過氧化氫溶液浸泡15～20 min，清洗2～3次，去離子水浸泡26～30 h，吸脹后25 ℃恒溫培養。待根長至1～2 cm時，選取初生根尖生長良好、根長一致的蠶豆，隨機分成14組，每組30個備用[13]。

1.2.3 蠶豆根尖的處理及恢復培養 將上述備用蠶豆中5組分別用配制的5個濃度的TMV溶液處理4 h，另5組用濃度為10.8 μg/mL的TMV溶液分別處理4、8、12、16和20 h，并以去離子水處理為陰性對照（CK1），以PBS液處理為陽性對照 （CK2），以上處理過的蠶豆用去離子水浸洗3次后25 ℃恢復培養24 h。

1.2.4 蠶豆根尖的固定與解離 恢復培養后的蠶豆分別剪下根尖前端1 cm用卡諾固定液固定24 h后，用體積分數90%和70%的乙醇各浸洗兩次，每次0.5 h，體積分數70%的乙醇4 ℃保存[13]。將固定好的蠶豆根尖用去離子水浸洗2次，每次5 min，1 mol/L HCl 60 ℃水浴解離5 min，去離子水浸洗2次，每次5 min。

1.2.5 制片和鏡檢 取2 mm左右根尖分生組織，涂片，染色，壓片。每個處理及對照組蠶豆根尖至少鏡檢20個裝片，每個裝片在高倍鏡下觀察和統計約1 000個細胞的微核數。細胞微核率（MCN） =含微核的細胞數/觀察細胞總數×1 000‰

2 結果與討論

2.1 TMV溶液濃度對蠶豆根尖微核率的影響

試驗用5個濃度的TMV溶液和PBS、去離子水各處理蠶豆根尖4 h，蠶豆根尖產生的微核率及污染指數結果見表1，去離子水和PBS處理的蠶豆根尖微核率都低于3‰，5個濃度的TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率都高于5‰。不同處理的各組間進行方差分析和多重比較表明，用去離子水和PBS處理的蠶豆根尖微核率與TMV溶液處理的的蠶豆根尖各組間微核率差異均極顯著（P<0.01），且二者間差異也極顯著（P<0.01）；2.7 μg/mL TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率與5.4 μg/mL和8.1 μg/mL TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率差異不顯著，但與10.8 μg/mL和13.5 μg/mL TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率差異極顯著（P<0.01），5.4 μg/mL和8.1 μg/mL TMV溶液處理組與13.5 μg/mL TMV溶液處理組相比差異均顯著（P<0.05）。不同濃度TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率相關性分析結果顯示，相關系數r=0.982（P=0.003<0.01）。污染指數（PI）=樣品MCN平均值/對照組MCN平均值。污染指數在0～1.5區間為基本沒有污染，1.5～2.0區間為輕污染，2.0～3.5區間為中污染，3.5以上為重污染[14]。

2.2 處理時間對蠶豆根尖微核率的影響

同一濃度的TMV溶液處理不同時間后蠶豆根尖的微核率見表2，去離子水處理的所有組蠶豆根尖微核率均值都低于2‰，PBS處理的蠶豆根尖微核率略高于去離子水處理，僅有處理12 h的蠶豆根尖微核率略高且標準誤較大，其他均低于5‰，TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率都高于5‰。二因素方差分析和多重比較表明，3種處理方式間有極顯著的差異（P<0.01）。去離子水和PBS處理的蠶豆根尖微核率與TMV溶液處理的蠶豆根尖微核率相比差異均極顯著（P<0.01）。TMV溶液處理蠶豆根尖不同時間后各組間微核率的方差分析和多重比較表明，不同處理時間蠶豆根尖微核率沒有顯著差異（P>0.01），相關性分析結果顯示，相關系數r=0.312（P=0.610）。

TMV一般不侵染豆科作物，周雪平等[15]從蠶豆上分離鑒定了TMV，該分離物在蠶豆上致病力很強。本研究發現TMV溶液可以誘導蠶豆根尖細胞微核的形成，具有一定的遺傳毒性，致使寄主染色體發生一定程度的畸變，長期以來很可能影響寄主在環境中的生存、遺傳和進化。鄭耀通等[16，17]研究認為TMV可在不同的水體環境中存活相當長時間，且有可能隨流動的水體而造成遠距離傳播。植物病毒在水體環境中對農業生產和環境污染的危險預測已十分迫切。蠶豆根尖細胞微核技術具有經濟、簡便、可靠等優點，在一定范圍內可推廣使用，因此認為，蠶豆根尖細胞微核技術可以作為一種煙草花葉病毒遺傳毒性檢測技術。由于細胞微核技術從細胞遺傳學水平探討植物遺傳物質的改變狀況與環境污染程度的相互關系[18，19]，陳光榮等[14]引入污染指數的概念并把微核率與污染程度聯系起來，根據微核率計算得出污染指數及相應的污染程度。本研究中5個濃度的TMV溶液都是中度以上的污染，這一結果為評價水體中植物病毒的環境效應提供了試驗依據。

3 結論

1）不同濃度的TMV溶液處理蠶豆根尖微核率的結果表明，不同處理組間差異極顯著（P<0.01），且兩對照與TMV溶液處理的各組間差異極顯著（P<0.01），兩對照間差異也極顯著（P<0.01）；TMV溶液濃度與各處理蠶豆根尖微核率的相關性較強（r=0.982），而且極顯著（P=0.003<0.01），表明蠶豆根尖微核率隨TMV溶液處理濃度的升高而增加。可見，蠶豆根尖細胞微核技術應用于煙草花葉病毒遺傳毒性監測是可行的。

2）同一濃度的TMV溶液處理不同時間后蠶豆根尖的微核率間沒有顯著差異（P>0.01），即蠶豆根尖的微核率與處理時間相關性不強（r=0.312）。

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（責任編輯 張 毅）