超聲波法提取馬鞭草黃酮條件的優化及其抗菌活性研究

摘要：采用超聲波法提取馬鞭草（Verbena officinalis）中總黃酮，設計單因素試驗和正交試驗考察超聲波功率、乙醇體積分數、超聲波處理時間和料液比對總黃酮提取效果的影響，優化提取工藝條件。并采用紙片瓊脂擴散法考察馬鞭草提取物對幾種微生物的抑制作用。結果表明，優化的馬鞭草總黃酮提取條件為乙醇體積分數60%、超聲波功率350 W、超聲波處理時間50 min、料液比m馬鞭草∶V乙醇=1∶30（g/mL）。抑菌試驗表明，馬鞭草黃酮類化合物對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白假絲酵母（Candida spp.）、青霉（Penicillium citrimum）、黑曲霉（Aspergillus niger）均有一定的抑制作用。

關鍵詞：超聲波法；馬鞭草（Verbena officinalis）；黃酮類化合物；抑菌活性

中圖分類號：S567.23+9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0645-04

馬鞭草（Herba Verbenae）為馬鞭草科（Verbenaceae）植物馬鞭草（Verbena officinalis）的地上部分，具有活血散瘀、截瘧、解毒及利水消腫等功效，主治癥瘕積聚、經閉痛經、瘧疾、喉痹、癰腫、水腫、熱淋等癥[1]。近年來對馬鞭草活性組分的研究多有報道，其所含化學成分種類較多，主要有環烯醚萜、黃酮、三萜、甾體等[2-5]。黃酮類化合物是廣泛存在于植物中的一類重要的化合物，其生物活性多種多樣，如對心血管系統的作用、抗肝臟毒性、抗炎及提高機體免疫力、雌激素樣作用、抗菌及抗病毒、抗氧化作用等，在食品和醫藥工業領域應用廣泛[6]，因此對馬鞭草中黃酮類化合物的研究具有重要意義。傳統的黃酮類化合物提取方法主要有醇滲漉法、浸漬法、索氏抽提法和加熱回流法等，存在提取時間長、溶劑用量大、提取率低等問題。近年來，超聲波提取法因具有設備簡單、操作時間短、效率高等優點而得到廣泛使用[7，8]。為了更好地開發利用馬鞭草，本研究利用超聲波法提取其總黃酮，采用單因素試驗和正交試驗優化提取工藝，并對馬鞭草提取產物進行體外抑菌試驗，以期為該資源的利用和開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鞭草干全草購自保定市中藥材公司，經粉碎后過60目濾網，得到預處理的馬鞭草粉末。供試微生物菌株由河北大學病原微生物實驗室提供，包括大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白假絲酵母（Candida spp.）、青霉（Penicillium citrimum）、黑曲霉（Aspergillus niger），細菌采用LB培養基培養，酵母及霉菌采用通用真菌培養基YEPD。

主要儀器包括超聲波破碎儀、752型紫外可見分光光度計、電子天平、離心機、粉碎機等。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 參照文獻[9]，以蘆丁為標準品，測定其不同濃度標準液在507 nm處的吸光度，繪制蘆丁標準曲線，以標定提取液中總黃酮含量。

1.2.2 馬鞭草總黃酮類化合物的提取 將馬鞭草粉末在60 ℃下烘干12 h，精確稱量2.00 g，加入50 mL一定濃度的乙醇溶液，置于超聲波細胞粉碎儀內進行超聲波輔助提取。為避免超聲波處理過程中溫度升高過快，破壞其中活性產物，超聲波處理過程中使用冰浴降溫。處理結束后除去固體雜質，收集濾液，濾液經減壓蒸餾濃縮后8 000 r/min離心10 min以進一步除去固體雜質，得粗提物，置于100 mL容量瓶中定容，為待測溶液，4 ℃冰箱保存備用。

1.2.3 單因素試驗 設置單因素試驗考察超聲波功率、乙醇體積分數、超聲波處理時間和料液比（m馬鞭草∶V乙醇，g/mL）對馬鞭草中總黃酮提取率的影響。①超聲波功率。準確稱取6份馬鞭草粉末各2.00 g置于錐形瓶中，加入50.00 mL 體積分數50%的乙醇溶液作為溶劑，設定超聲波功率分別為200、250、300、350、400、450 W，超聲波提取30 min，提取溫度30 ℃，提取液定容到100 mL，測定總黃酮含量。②乙醇體積分數。準確稱取6份馬鞭草粉末各2.00 g置于錐形瓶中，分別加入50.00 mL體積分數40%、50%、60%、70%、80%、85%的乙醇溶液作為溶劑，設定超聲波功率300 W，超聲波處理時間30 min，提取溫度30 ℃，浸提液定容到100 mL，測定總黃酮含量。③超聲波處理時間。準確稱取7份馬鞭草粉末各2.00 g置于錐形瓶中，加入50.00 mL體積分數50%的乙醇溶液作為溶劑，設定超聲波處理時間分別為10、20、30、40、50、60、70 min，超聲波功率350 W，提取溫度30 ℃，浸提液定容到100 mL，測定總黃酮含量。④料液比。準確稱取6份馬鞭草粉末各2.00 g置于錐形瓶中，分別加入30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00 mL體積分數50%的乙醇溶液作為提取溶劑，設定超聲波功率350 W，超聲波處理時間30 min，提取溫度30 ℃，浸提液定容到100 mL，測定總黃酮含量。

1.2.4 正交試驗 在單因素試驗的基礎上，設置正交試驗以進一步優化超聲波法提取馬鞭草中總黃酮的工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

1.2.5 抑菌試驗 將滅菌后的專用藥敏紙片浸于50 mL浸提液中，浸泡24 h使其充分吸收提取液，以滅菌水為空白對照，采用紙片瓊脂擴散法測定抑菌圈直徑，以反映供試品的抑菌能力。取液體培養基活化培養好的供試菌0.1 mL，用無菌玻璃刮棒均勻涂布于相應的瓊脂培養平板上，用無菌鑷子將含有提取液的紙片貼于含菌瓊脂平板表面。紙片應貼得均勻，各紙片中心距離不小于24 mm，紙片至平板內邊緣距離大于15 mm。將放好濾紙片的含菌培養皿恒溫培養，細菌37 ℃培養24 h，真菌28 ℃培養48 h，用游標卡尺測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲波功率對馬鞭草總黃酮提取率的影響 在m馬鞭草∶V乙醇=1∶25（g/mL）、乙醇體積分數50%、超聲波處理時間30 min時，不同超聲波功率對馬鞭草總黃酮提取的影響結果見圖1。由圖1可以看出，試驗范圍內馬鞭草中總黃酮的提取率隨超聲波功率的增大而逐漸提高，但超聲波功率大于350 W后，馬鞭草總黃酮的提取率隨超聲波功率增大而升高的趨勢變緩。

2.1.2 乙醇體積分數對馬鞭草總黃酮提取率的影響 在m馬鞭草∶V乙醇=1∶25（g/mL）、超聲波功率350 W、超聲波處理時間30 min的條件下，以不同體積分數的乙醇作為提取溶劑，馬鞭草總黃酮提取率結果見圖2。由圖2可知，乙醇體積分數由30%升高到70%，馬鞭草總黃酮提取率升高，之后再增加乙醇體積分數，馬鞭草中黃酮類化合物的提取率反而有所降低，可能是乙醇體積分數過高會造成植物細胞內一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出增加，與黃酮類化合物競爭，從而導致黃酮類化合物提取率下降。

2.1.3 超聲波處理時間對馬鞭草總黃酮提取的影響 在m馬鞭草∶V乙醇=1∶25（g/mL）、乙醇體積分數60%、超聲波功率350 W的條件下考察超聲波處理時間對總黃酮提取率的影響。由圖3可以看出，超聲波處理時間由10 min延長到30 min，提取率隨處理時間的延長迅速提高；超過30 min時提取率的升高趨勢趨于平緩；超聲波處理時間長于50 min后總黃酮提取率反而降低。這是因為處理時間較短時細胞內外溶質的濃度差很大，細胞內物質極易釋放到提取液中。隨著超聲波處理時間的延長，馬鞭草顆粒中黃酮類化合物相對含量降低。同時由于超聲波瞬間產生大量的熱和強烈的空化效應，可能對黃酮的結構有一定的破壞作用，所以超聲波處理時間不宜過長。

2.1.4 料液比對馬鞭草總黃酮提取的影響 在乙醇體積分數60%、超聲波功率350 W、超聲波處理時間40 min時，考察不同料液比對馬鞭草中總黃酮提取率的影響，結果見圖4。隨著提取溶劑用量的增加，總黃酮提取率有一定提高，說明增大提取液用量有利于馬鞭草中黃酮類化合物的溶出。m馬鞭草∶V乙醇由1∶15降低到1∶30，提取率快速升高，之后隨提取溶劑用量的增加提取率升高的速度變緩。低的料液比有利于提取物的溶出，但是過大的提取劑用量會造成溶劑的浪費，并且不利于后續黃酮類化合物的分離純化。因此提取劑用量不宜過高或過低。

2.2 正交試驗結果

采用正交試驗進一步考察乙醇體積分數、超聲波功率、超聲波處理時間、料液比4個因素對馬鞭草總黃酮提取率的影響，結果見表2。由表2可知，各因素對馬鞭草中總黃酮的提取率的影響由大到小依次為超聲波處理時間、料液比、超聲波功率、乙醇體積分數。最佳試驗組合為A2B2C3D3，即乙醇體積分數60%、超聲波功率350 W、超聲波處理時間50 min、m馬鞭草∶V乙醇=1∶30（g/mL）。在該試驗條件下提取馬鞭草總黃酮進行驗證試驗，重復3次，得到提取液中總黃酮含量為27.53 μg/mL，計算得到總黃酮提取率為1.377%。

2.3 馬鞭草粗提物的抑菌試驗結果

使用優化得到的方法提取馬鞭草中總黃酮，得到浸提液經減壓蒸發去除乙醇，采用紙片瓊脂擴散法考察馬鞭草黃酮類化合物對幾種模式微生物（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白假絲酵母、青霉菌、曲霉菌）的抑制特性，抑菌試驗結果見表3。試驗結果表明馬鞭草黃酮類化合物對革蘭氏陰性和陽性細菌均具有較強的抑制作用，對潛在致病菌金黃色葡萄球菌和腸道桿菌具有很強的抑制作用，對白假絲酵母也有一定的抑制作用，為馬鞭草藥物的抗菌臨床應用提供了有力證據，并且有助于馬鞭草的進一步藥物開發應用。

3 小結與討論

本試驗采用超聲波法提取馬鞭草中總黃酮，在單因素試驗的基礎上設計正交試驗優化提取工藝條件，得到優化的提取乙醇體積濃度為60%、超聲波功率350 W、超聲波處理時間50 min、m馬鞭草∶V乙醇=1∶30（g/mL），得到提取液中總黃酮含量為27.53 μg/mL，總黃酮提取率為1.377%。超聲波輔助法提取馬鞭草中黃酮類化合物較傳統方法具有高效、低能耗、污染小等優點，是一種極具潛力的提取方法。抑菌試驗結果發現馬鞭草黃酮類化合物具有較強的抗菌作用，對革蘭氏陰性和陽性細菌均抑制明顯，對馬鞭草總黃酮粗提物中各類物質進行抗菌研究具有重要理論意義，值得進一步研究考察。

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