蘇云金芽孢桿菌Cry2Aa蛋白的體外表達及純化

摘要：根據大腸桿菌密碼子偏好性對蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）cry2Aa基因進行優化，并合成全長基因，將cry2Aa基因克隆到表達載體pET-44a上，轉化到大腸桿菌Rosetta中進行誘導表達，優化表達條件，采用親和層析和SDS-PAGE膠回收純化，Western blot鑒定回收產物。結果表明，IPTG濃度為0.50 mmol/L、27 ℃誘導4 h時Cry2Aa蛋白表達量最高，SDS-PAGE膠回收Cry2Aa純化蛋白所得的產量高于親和層析法。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）；Cry2Aa蛋白；表達；純化

中圖分類號：S476+11 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0702-04

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種能夠產生多種殺蟲晶體蛋白（Cry）的土壤細菌[1，2]，Bt的cry基因已成功轉入很多主要農作物（Bt農作物），包括玉米、棉花、西紅柿等，使它們具有抗蟲特性[3-6]。Cry1類殺蟲晶體蛋白對鱗翅目害蟲具有特異毒性，在微生物和植物基因工程中得到了廣泛的應用，但其存在著殺蟲譜狹窄、昆蟲產生抗藥性等問題[7，8]。Cry2類蛋白在結構和殺蟲機制上不同于Cry1類，如Cry2Aa既對鱗翅目害蟲有毒性又能殺害雙翅目害蟲[9]。研究顯示轉cry2Aa基因的鷹嘴豆對豆莢蛀蟲有較強的毒性[10]，而轉cry2Aa基因的水稻對其傳粉昆蟲如中華通草蛉無危害性[11]。本研究合成密碼子優化的cry2Aa基因，體外重組表達Cry2Aa蛋白并進行優化，以期為進一步求證Cry2Aa的安全性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇云金芽孢桿菌Cry2Aa蛋白序列由華中農業大學林擁軍教授提供，與NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov）中相關序列（M31738）僅有少數氨基酸不同。pET-44a質粒、大腸桿菌TOP10和Rosetta菌株由廣州市過敏反應與臨床免疫重點實驗室保存；Strep Trap HP預裝柱和低分子量蛋白Marker購自GE公司；StrepⅡ標簽抗體購于Merck公司。cry2Aa基因的上下游引物分別為5′CATATGAACAACGTCCTGAACTCCGGT 3′（劃線部分為NdeⅠ酶切位點），5′CTGCAGGTACAGCGGCGGTAAATTAGT 3′（劃線部分為PstⅠ酶切位點），由上海博尚生物技術有限公司合成。

1.2 密碼子優化

根據大腸桿菌同義密碼子的偏好性，采用在線軟件Condon Usage Database（http：//www. kazusa.or.jp/codon/）對cry2Aa基因進行密碼子優化，之后手工校正。

1.3 重組蛋白的誘導表達及親和純化

密碼子優化后的cry2Aa基因序列送交上海博尚生物技術有限公司進行全基因合成，合成基因連接pUC57，轉化到大腸桿菌TOP10菌株中保存。抽提pUC57-Cry2Aa，用NdeⅠ和PstⅠ雙酶切后亞克隆到表達載體pET-44a，構建pET-44a-Cry2Aa，轉化表達宿主菌Rosetta進行IPTG誘導表達，優化表達條件以獲得最佳誘導表達參數。表達菌擴大培養，超聲波破碎，收集破碎上清和沉淀，沉淀用含6 mol/L尿素的緩沖液裂解，利用AKTA-FPLC系統，通過親和層析純化出帶有StrepⅡ標簽的蛋白，具體操作遵照Strep Trap HP預裝柱的使用說明書進行。

1.4 SDS-PAGE膠回收

將Cry2Aa蛋白進行常規SDS-PAGE；電泳后采用KCl染色，用切膠刀準確切下目的蛋白條帶，將膠片裝入透析袋中，使用水平電泳儀進行電泳，使膜上的蛋白質回到洗脫液中。電泳結束后用ddH2O進行透析。最后收集透析袋中的液體，凍干。

1.5 Western blot分析

純化蛋白或誘導菌裂解液經SDS-PAGE電泳后將凝膠上的蛋白質電轉移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的PBST緩沖液室溫封閉2 h后，加入已偶聯HRP的StrepⅡ標簽抗體（1∶4 000稀釋），4 ℃孵育過夜；用PBST和PBS室溫下在脫色搖床上進行洗滌；最后用二氨基聯苯胺（DAB）底物液顯色，檢測目的蛋白特異性及分子量大小。

2 結果與分析

2.1 cry2Aa基因的合成及重組表達載體pET-44a-Cry2Aa的構建

經密碼子優化后人工合成cry2Aa基因，應用大腸桿菌克隆擴增質粒pUC57-Cry2Aa，雙酶切獲得1 908 bp的cry2Aa基因序列（圖1），進一步將cry2Aa基因亞克隆到表達載體pET-44a中，轉化表達宿主菌Rosetta，用PCR及測序方法鑒定克隆是否成功，陽性克隆PCR檢測結果如圖2，測序結果顯示陽性克隆序列與原始序列同源性為100%。

2.2 Cry2Aa重組蛋白的誘導表達

對表達宿主菌的誘導溫度（37、27、20、15 ℃）、時間（0、1、2、3、4、5、6 h）及IPTG濃度（0、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50 mmol/L）進行優化，SDS-PAGE檢測結果如圖3所示。由圖3可知，終濃度為0.50 mmol/L的IPTG在27 ℃誘導4 h，目的蛋白表達量最高，目標片段大小約為65 ku。

2.3 Cry2Aa重組蛋白的純化

不同溫度下誘導Cry2Aa重組蛋白表達的菌體超聲破碎后收集上清和沉淀，沉淀經6 mol/L尿素變性過夜，SDS-PAGE電泳檢測見圖4。由圖4可以看出，誘導溫度為15 ℃時重組蛋白在上清和包涵體中均有表達，其余誘導溫度下則形成難溶的包涵體。誘導溫度為15 ℃時上清和復性后的包涵體經親和層析純化雖可得到較純的Cry2Aa重組蛋白（圖5A），但產量較低；而采用SDS-PAGE膠回收純化也可得到純度較高的Cry2Aa重組蛋白（圖5B），且產量相對較高。

2.4 純化蛋白的Western blot檢測

由于重組蛋白帶有StrepⅡ標簽，因此利用StrepⅡ標簽的單克隆抗體對表達蛋白進行Western blot初步鑒定，結果顯示，在約65 ku處有明顯的特異性條帶（圖6），與上述純化的目的蛋白分子量大小一致。

3 小結與討論

通過綜合考慮大腸桿菌中密碼子使用的偏好性、GC含量、mRNA二級結構等因素，對cry2Aa基因的密碼子進行了優化，并在目的基因的C端添加StrepⅡ標簽。StrepⅡ標簽蛋白的分子較?。▋H含8個氨基酸），對蛋白活性影響較小，無需進行常規的標簽去除，溫和的洗脫條件可以確保目的蛋白的活性。本研究重組誘導表達獲得了一條大小約為65 ku的特異性蛋白，與Cry2Aa氨基酸組成預測的分子量71 ku雖有少量偏差，但與Kumar等[12]的結果一致，這可能是由于重組表達的蛋白空間折疊構象導致電泳結果差異。Cry2Aa蛋白由于其性質的特殊性，要求pH約為12才能完全溶解，給純化帶來一定的困難，本研究分析了不同誘導溫度下表達蛋白的可溶形式，結果發現低溫（15 ℃）誘導時，表達的重組蛋白部分為可溶蛋白存在于上清，部分為可被6 mol/L尿素變性的包涵體。此外，進一步研究發現采用親和層析法獲得的目的蛋白產量較低，不能完全滿足后續實驗需求，而采用SDS-PAGE膠回收可獲得足夠量的Cry2Aa純化蛋白，為后續實驗制備單克隆抗體提供了抗原，并為體外實驗求證其安全性奠定了重要的物質基礎。

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