純化前后半枝蓮多糖的藥效學研究

摘要：采用Sevage法純化半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）多糖，并通過苯酚-硫酸法測定多糖含量；進行急性毒性試驗考察半枝蓮多糖對小鼠的毒性；通過體內移植腫瘤試驗測定不同劑量純化前后半枝蓮多糖對小鼠S180瘤的抑制作用。純化后半枝蓮多糖的純度為49.99%；急性毒性試驗表明800 mg/kg及以下劑量半枝蓮多糖對小鼠無毒。純化后半枝蓮多糖的抑瘤率低于半枝蓮粗多糖，100 mg/kg半枝蓮粗多糖的抑瘤率為46.85%。

關鍵詞：半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）；多糖；純化；急性毒性；抑瘤率

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0659-03

半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don），別名狹葉韓信草、并頭草、牙刷草等，為唇形科黃芩屬植物，以干燥全草入藥，本品味辛、苦，性寒，歸肺、肝、腎經，有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫的功能，是一種常用中藥[1]。研究表明，半枝蓮水提物和醇提物有明顯的抗肺癌、消化系統癌、肝癌、乳腺癌、絨膜上皮癌的活性。本研究采用Sevege法將純度為30%的半枝蓮多糖進行純化，采用限量試驗測定其體內急性毒性[2，3]，并比較純化前后半枝蓮多糖的抑瘤效果，為半枝蓮多糖藥效學評價和抗腫瘤作用與免疫作用機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KM小鼠，體重（20.0±2.0） g，雌雄各半。半枝蓮多糖（純度30%），徐州弘康科技有限公司產品；黃芪多糖（APS），由哈爾濱商業大學博士后工作站提供；環磷酰胺（CTX），江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號10061921；生理鹽水，哈爾濱三聯藥業有限公司，批號100921A14。氯仿，天津市耀華化學試劑有限責任公司，批號20090820；正丁醇，天津市標準科技有限公司，批號20091206；濃硫酸，哈爾濱市新達化工廠，批號101103；苯酚，廊坊市興達化工有限公司，批號20060213；H2O2，沈陽市新西試劑廠，批號20090711；葡萄糖，北京奧博星生物技術有限責任公司，批號2010223；0.01 mol/L NaHCO3、0.001 mol/L EDAE、無水乙醇，天津市永大化學試劑開發中心，批號20091108；氨水，哈爾濱市新達化工廠，批號090524。

1.2 試驗方法

1.2.1 半枝蓮多糖樣品的純化[4-7] ①除蛋白。取半枝蓮多糖5 g溶于100 mL蒸餾水中，將20 mL Sevage液（氯仿與正丁醇體積比4∶1）加入多糖溶液中，混合物劇烈振搖5 min后4 000 r/min離心10 min，取上層水相反復操作6次。②氧化脫色。除去蛋白后的多糖溶液用體積分數30%的氨水調節pH 8～9，加質量分數10%的雙氧水50 mL，置4 ℃冰箱24 h。③除小分子物質。采用透析法除去小分子物質。④醇沉。將透析過的多糖溶液經70 ℃減壓濃縮至25 mL，待自然冷卻后加入體積分數95%的乙醇調節乙醇體積分數為80%，放置1 d。⑤干燥。將沉淀用適量無水乙醇、丙酮洗滌，干燥后得棕黃色半枝蓮多糖粉末。

1.2.2 多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[7-8]測定溶液中多糖的含量。①葡萄糖標準曲線的繪制。精確量取濃度分別為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的葡萄糖標準溶液各1.0 mL，用蒸餾水補足至2.0 mL，加5%苯酚溶液1.0 mL混勻，迅速加濃硫酸5.0 mL，振搖2 min。用蒸餾水作空白對照，室溫放置20 min，流水沖洗。用紫外分光光度計檢測其在490 nm處的吸光度。葡萄糖濃度在10～60 μg/mL范圍內濃度（C）與吸光度（A）呈良好的線性關系（圖1），回歸方程為A=0.013 C+0.028，r=0.997 9。②半枝蓮多糖含量的測定[8-11]。配制濃度為100 μg/mL的半枝蓮多糖溶液，精確量取1.0 mL，稀釋后按繪制葡萄糖標準曲線的方法測其A490 nm，計算多糖含量（以葡萄糖計）。

1.2.3 半枝蓮多糖溶液的制備 將純化前后的半枝蓮多糖加生理鹽水適量溶解，觀察溶液均勻度，以不出現肉眼可見的小結晶顆粒的最大濃度作為半枝蓮多糖體內試驗的試劑[12]，制成32 mg/mL的飽和溶液，并稀釋成濃度分別為1、2、4、8、12、16 mg/mL的溶液。

1.2.4 急性毒性試驗 選用體重（20.0±2.0）g的健康KM小鼠10只，雌雄各半，以800 mg/kg（32 mg/mL，0.5 mL/只）劑量腹腔注射給藥，每天2次。給藥后觀察7 d，觀察期間逐日記錄動物的毒性反應情況及死亡狀況。

1.2.5 半枝蓮多糖抑瘤率的測定 選用體重（20.0±2.0）g的健康KM小鼠150只，隨機分為15組，每組10只，雌雄各半。抽取接種第7 d的生長良好的S180荷瘤小鼠腹水（活癌細胞數>97%），3倍體積無菌生理鹽水稀釋，按0.2 mL/只（細胞濃度約2×107個/mL）小鼠右前腋皮下接種，整個操作應在無菌條件下進行，30 min內操作完畢。小鼠接種S180瘤24 h后分別按400、300、200、100、50、25 mg/kg的劑量腹腔注射半枝蓮粗多糖和半枝蓮純化多糖溶液，以100 mg/kg黃芪多糖溶液和30 mg/kg環磷酰胺溶液為陽性對照，空白對照組注射生理鹽水0.2 mL/只，連續給藥7 d，1次/d，停藥后次日處死，稱取瘤重，計算抑瘤率。

2 結果與分析

2.1 半枝蓮多糖的純化結果

干燥后得棕黃色半枝蓮多糖粉末0.3 g，收率為6%。按“1.2.2”的方法測定純化后半枝蓮多糖的含量，計算得到純化產物半枝蓮多糖的純度為49.99%，比純化前的純度提高了19.99個百分點。

2.2 急性毒性試驗結果

一日內兩次腹腔注射小鼠半枝蓮多糖800 mg/kg，第一天給完藥時小鼠的活動能力和食欲有所下降，第二天即恢復正常。之后給藥7 d內未見動物死亡，并且毛色、食欲均正常，無明顯的機體病變。

2.3 純化前后半枝蓮多糖的抑瘤率

不同劑量純化前后半枝蓮多糖對小鼠S180瘤的抑瘤率結果見表1。在試驗范圍內，純化前后半枝蓮多糖的抑瘤率均隨其劑量的增加呈先升高后降低的趨勢，劑量為100 mg/kg時純化前后半枝蓮多糖的抑瘤率均為最高，此時半枝蓮純化多糖組抑瘤率為27.63%，半枝蓮粗多糖組抑瘤率為46.85%，與空白對照、50、100和200 mg/kg半枝蓮粗多糖組抑瘤率相比有明顯的差異。純化后半枝蓮多糖的抑瘤效果明顯弱于粗多糖的，原因可能是純化過程中被去除的蛋白或小分子物質也參與或協助了多糖的抗腫瘤作用。

3 小結與討論

應用Sevage法除蛋白、雙氧水脫色、透析、醇沉，純化后半枝蓮多糖的純度比半枝蓮粗多糖的純度有明顯提高，采用苯酚-硫酸法測多糖含量，測定時最好在20 min內完成，時間過長吸光度會有所下降。

急性毒性的測定可為新藥研發過程中各種劑量、臨床上的各監測指標等提供參考的依據。本試驗中半枝蓮多糖毒性很低，所以根據《藥理試驗方法學》中的要求僅采用限量試驗進行急性毒性試驗。半枝蓮多糖一日內兩次給予小鼠800 mg/kg的劑量，7 d內未見動物死亡，并且毛色、食欲均正常，無明顯的機體病變，這說明受試動物在此劑量下基本沒有毒性反應，即可認為半枝蓮多糖在800 mg/kg及以下劑量都是無毒的。

體內移植腫瘤試驗觀察到半枝蓮多糖對小鼠S180瘤有抑制作用。連續腹腔注射給藥7 d后，純化前半枝蓮多糖的抑瘤效果明顯優于純化后的半枝蓮多糖，100 mg/kg半枝蓮粗多糖抑瘤率為46.85%，而純化后半枝蓮多糖抑瘤率不符合關于抗腫瘤中草藥有效性的標準（抑瘤率>30%）[13]，故采用30%半枝蓮多糖完成后續研究。

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