體外循環(huán)中心肌缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡研究

摘要：隨著體外循環(huán)在心內(nèi)直視手術(shù)中的廣泛應(yīng)用，由此引起的心肌缺血再灌注損傷引起人們的普遍關(guān)注。近年研究表明，缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞死亡有兩種機(jī)制，即壞死和凋亡，并且凋亡是重要原因。如何減少心肌細(xì)胞凋亡已成為心肌保護(hù)的研究熱點(diǎn)。綜述缺血再灌注損傷引起心肌細(xì)胞凋亡的證據(jù)、可能的相關(guān)機(jī)制、參與調(diào)節(jié)的相關(guān)基因分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、以及初步闡述目前減少心肌凋亡的方法。

關(guān)鍵詞：體外循環(huán)心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞凋亡

【中圖分類(lèi)號(hào)】R4【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1008-1879（2012）10-0006-02

心內(nèi)直視手術(shù)中為了獲得安靜無(wú)血的手術(shù)野，需要暫時(shí)阻斷冠狀動(dòng)脈循環(huán)血流。心肌在第一次阻斷冠狀動(dòng)脈灌注，其缺血缺氧期細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)及超微結(jié)構(gòu)改變并不十分明顯。當(dāng)重新恢復(fù)冠狀動(dòng)脈血流后，則可出現(xiàn)嚴(yán)重的病理性心肌細(xì)胞損害和頑固性心律失常，心肌肥厚或術(shù)前存在冠狀動(dòng)脈供血不足的患者更為明顯。這種在缺血期心肌改變不明顯，而在重新灌注后才充分表現(xiàn)出來(lái)的心肌損害稱(chēng)之為體外循環(huán)的“心肌缺血再灌注損傷”。隨著分子生物學(xué)研究的迅猛發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)凋亡是引起心肌缺血再灌注的重要原因^[1]。心肌再灌注雖然恢復(fù)了血流但同時(shí)也可能加速了受損心肌細(xì)胞的凋亡過(guò)程。故細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

1細(xì)胞凋亡

1.1細(xì)胞凋亡的概念。1972年，澳大利亞的病理學(xué)家Kerr等首次從形態(tài)學(xué)上描述了這種不同于壞死的細(xì)胞死亡方式，現(xiàn)在分子生物學(xué)將其定義為在一定生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身程序，自己結(jié)束生命的過(guò)程。又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡，即在一定時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞按一定的程序發(fā)生死亡，這種死亡具有嚴(yán)格的基因時(shí)控性和選擇性。

1.2細(xì)胞凋亡的特征。形態(tài)學(xué)改變首先表現(xiàn)為細(xì)胞核的一系列變化，如染色質(zhì)斷裂、聚集，進(jìn)而固縮、核膜崩解、細(xì)胞胞質(zhì)空泡變，最后包膜突出，形成凋亡小體。生化改變，主要表現(xiàn)為基因組DNA有規(guī)律的片段化斷裂及蛋白質(zhì)的不可逆性降解。凋亡細(xì)胞在瓊脂糖凝膠電泳上顯示出典型DNA“梯狀”條帶，目前認(rèn)為，這是判斷細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要標(biāo)志^[2]。

2細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的存在依據(jù)

1944年，Gottlieb等首先在兔心臟上發(fā)現(xiàn)再灌注損傷促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。Fliss等^[3]采用原位末端標(biāo)記和瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)，缺血再灌注損傷的大鼠有典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變和DNA梯狀電泳改變，即再灌注損傷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。姚震等^[4]以缺血30-60min后再灌注時(shí)損傷明顯，說(shuō)明心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生率與此前心肌缺血時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。

3細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷中的發(fā)生機(jī)制

3.1氧自由基學(xué)說(shuō)。心肌缺血再灌注時(shí)可產(chǎn)生大量的氧自由基。氧自由基（OFR）增高明顯，生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)變性以及合成障礙，線粒體損傷，組織水腫，酶受體和離子通道活性及結(jié)構(gòu)改變，從而造成心肌損傷。細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧可通過(guò)多途徑誘致細(xì)胞凋亡，即可直接損傷DNA誘導(dǎo)凋亡，還可通過(guò)細(xì)胞膜誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激發(fā)相關(guān)調(diào)控基因?qū)е碌蛲觯渲芯€粒體起著重要的作用。

3.2鈣超載。缺血再灌注損傷時(shí)引起的鈣超載也是心肌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。①鈣超載可激活鈣依賴(lài)性核酸內(nèi)切酶，降解DNA鏈；②鈣超載可直接調(diào)節(jié)某些鈣敏感蛋白酶活性；③鈣可激活蛋白激酶C，激發(fā)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡；④線粒體內(nèi)大量Ca2+聚集，引起線粒體內(nèi)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，釋放細(xì)胞色素C入胞質(zhì)內(nèi)，進(jìn)一步激活Caspase誘致細(xì)胞凋亡。事實(shí)上，細(xì)胞內(nèi)鈣超載及氧自由基的過(guò)量表達(dá)是同一病理過(guò)程中的兩種不同現(xiàn)象，且互為因果關(guān)系^[5]。

3.3細(xì)胞因子與粘附分子大量表達(dá)。細(xì)胞因子是體內(nèi)白細(xì)胞及其它不同的細(xì)胞分泌的一類(lèi)小分子水溶性蛋白質(zhì)，具有多種細(xì)胞調(diào)節(jié)活性。在心肌缺血再灌注損傷中，活化的巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及心肌細(xì)胞本身可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子與粘附分子。細(xì)胞因子不僅可促進(jìn)心肌炎癥，而且還可與粘附分子相互作用而加重心肌細(xì)胞凋亡。白細(xì)胞介素-1，6，8（L-1；L-6；L-8）和腫瘤壞死因子（TNF）都參與了心肌缺血再灌注損傷。

4心肌缺血再灌注損傷時(shí)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控

4.1Bcl-2基因。Bcl-2是一種原癌基因，具有促進(jìn)細(xì)胞生存、抗凋亡作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的Bcl-2蛋白家族按功能可分為兩類(lèi)，一類(lèi)是像Bcl-2一樣具有抑制凋亡作用，如哺乳動(dòng)物的Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、A1、線蟲(chóng)Ced-9等，而另一類(lèi)具有促進(jìn)凋亡作用，如Bax、Bcl-Xs、Bak、Bad等。大多認(rèn)為其抗凋亡作用與Bcl-2的細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用及抑制鈣離子的跨膜運(yùn)動(dòng)有關(guān)。在細(xì)胞凋亡時(shí)Bcl-2的表達(dá)減少。

4.2P53基因。通過(guò)Bax/Bcl-2，F(xiàn)as/Apol，IGF-Bp3等蛋白，P53可完成對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。P53可以上調(diào)Bax的表達(dá)水平，以及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)共同完成促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。P53還可以通過(guò)死亡受體蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡，有學(xué)者認(rèn)為P53還可直接刺激線粒體釋放高毒性的氧自由基來(lái)引發(fā)凋亡。

4.3半胱氨酸蛋白酶。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶，相當(dāng)于線蟲(chóng)中的Ced-3，這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，一旦被信號(hào)途徑激活，能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解，使細(xì)胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點(diǎn)：①酶活性依賴(lài)于半胱氨酸殘基的親核性；②總是在天冬氨酸之后切斷底物；③都是由大小亞基組成的異四聚體，大小亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個(gè)活性亞基。

4.4Fas基因。Fas又稱(chēng)作APO-1/CD95，屬TNF受體家族。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺細(xì)胞，激活T和B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后，會(huì)激活Caspase，導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。

4.5myc基因。在許多人類(lèi)惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過(guò)度表達(dá)，它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá)，作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，一方面它能激活那些控制細(xì)胞增殖的基因，另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，給細(xì)胞兩種選擇：增殖或凋亡。當(dāng)生長(zhǎng)因子存在，Bcl-2基因表達(dá)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之細(xì)胞凋亡。

5心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡的防治

隨著體外循環(huán)在心內(nèi)直視手術(shù)中的廣泛應(yīng)用，為了防治心肌缺血再灌注損傷，人們進(jìn)行多方面的研究，尤其對(duì)應(yīng)用藥物預(yù)防缺血再灌注損傷抱有濃厚興趣。

5.1缺血預(yù)處理。對(duì)心肌缺血再灌注損傷誘發(fā)細(xì)胞凋亡的影響，缺血預(yù)處理的心肌保護(hù)作用主要表現(xiàn)在它可上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)和下調(diào)Bax蛋白表達(dá)從而縮小心肌梗死面積。有實(shí)驗(yàn)證明，預(yù)處理可明顯減少凋亡細(xì)胞，認(rèn)為預(yù)處理減輕不可逆缺血再灌注損傷是在一定程度上通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的^[6]。

5.2鈣通道拮抗劑和氧自由基清除劑。在停跳液中加入鈣通道拮抗劑（異搏定、硝苯吡啶）或氧自由基清除劑（甘露醇、別嘌呤醇、中藥丹參、川穹嗪、黃芪、葛根素等）能有效抑制心肌凋亡。

5.3膜穩(wěn)定劑。抑肽酶可有效阻止體外循環(huán)中炎性介質(zhì)反應(yīng)，將其加入停跳液中對(duì)心肌細(xì)胞有明顯保護(hù)作用。

5.4熱休克處理。石永忠等^[7]報(bào)道，熱休克處理增加熱休克蛋白的表達(dá)，并且阻斷線粒體和受體死亡途徑，具有明顯的抗缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。

5.5其它藥物。葡萄糖酸鎂可清除氧自由基，干預(yù)Fas/FasL的表達(dá)從而減少心肌細(xì)胞凋亡。腺苷是一種內(nèi)源性的保護(hù)物質(zhì)，通過(guò)效應(yīng)器上特殊的腺苷受體發(fā)揮作用。給予外源性的腺苷興奮A1腺苷受體可增強(qiáng)心肌對(duì)缺血的耐受性，減輕頓抑心肌在灌注時(shí)所產(chǎn)生的損傷^[8]。

6結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞凋亡對(duì)缺血再灌注損傷產(chǎn)生重要的影響，細(xì)胞凋亡增多加重缺血再灌注損傷，抑制細(xì)胞凋亡則有助于防止缺血再灌注損傷。隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)等基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)的深入發(fā)展，對(duì)細(xì)胞凋亡方面的認(rèn)識(shí)和研究都在逐步提高和深化，用這些理論來(lái)重新認(rèn)識(shí)缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制，尋找有效的抗心肌凋亡的方法可能將大大提高這一領(lǐng)域臨床治療進(jìn)展，值得臨床工作者進(jìn)一步研究與探索。

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