E6AP與P53在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

【摘要】 目的 主要研究E6AP與P53在宮頸癌中的表達(dá)及其意義。方法 對(duì)45例宮頸癌、10例CIN及10例正常宮頸組織標(biāo)本采用免疫組化法檢測(cè)P53蛋白，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)E6AP基因的表達(dá)。結(jié)果 宮頸癌和CIN組織中P53蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率明顯高于正常宮頸，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。E6AP基因在宮頸癌組織中表達(dá)高于CIN及正常宮頸組織，E6AP的表達(dá)水平隨臨床分期的進(jìn)展而升高。P53陽(yáng)性宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于陰性組織中的E6APmRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 E6AP的表達(dá)與P53的表達(dá)關(guān)系密切，參與了宮頸上皮組織癌變的發(fā)生，并且在宮頸癌的發(fā)展中起重要作用。

【關(guān)鍵詞】 ：細(xì)胞內(nèi)的E6相關(guān)蛋白；p53蛋白；宮頸癌

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，是引起女性癌癥相關(guān)性死亡的重要原因。本文應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)宮頸癌中P53的表達(dá)，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)E6AP基因的表達(dá)，進(jìn)而分析它們?cè)趯m頸癌變及發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源和處理 選取2010年6月至2012年6月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)切除和活檢的宮頸癌患者標(biāo)本45例，CIN患者10例、正常宮頸組織10例，患者取標(biāo)本前均未接受放、化療及免疫治療。其中鱗癌41例，腺癌4例；按組織學(xué)分級(jí)：高分化19例，中分化19例，低分化7例；臨床分期按FIGO2009年標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例。36例行手術(shù)治療，術(shù)后證實(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8例，未轉(zhuǎn)移28例。將所取標(biāo)本組織分為兩塊，一塊10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片；另一塊經(jīng)液氮速凍后，儲(chǔ)存于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 免疫組化檢測(cè)P53蛋白表達(dá) 按照免疫組化方法SP二步法進(jìn)行，采用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：P53蛋白以胞漿、細(xì)胞核和核周緣出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量將陽(yáng)性表達(dá)分為3級(jí)：①陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%-10%為弱陽(yáng)性（+）；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)11%-50%為中度陽(yáng)性（++）；③陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性（-）。

1.3 RT-PCR技術(shù)檢測(cè)E6APmRNA的表達(dá) 目的基因在Pubmed中得到序列號(hào)，通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)E6AP及內(nèi)參β-actin的引物。然后使用Taq酶試劑盒及引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。以E6AP/β-actin光密度比值作為E6APmRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用計(jì)數(shù)資料采用Χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 P53蛋白的表達(dá) 45例宮頸癌組織中，P53陽(yáng)性表達(dá)21例，陽(yáng)性表達(dá)率為46.7%，其中鱗癌有19例（46.3%）、腺癌2例（50%）。比較不同宮頸癌組織學(xué)類(lèi)型中P53蛋白表達(dá)，無(wú)顯著差異（P>0.05）。P53蛋白在10例CIN組織中5例陽(yáng)性，陽(yáng)性率50%。10例正常宮頸組織中1例陽(yáng)性（10%）。P53蛋白在宮頸癌組織與CIN組織中陽(yáng)性表達(dá)相比較無(wú)明顯差異（P>0.05）。但宮頸癌、CIN與正常宮頸組織相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 E6APmRNA的表達(dá) 45例宮頸癌組織中，19例E6AP基因有表達(dá)，10例CIN組織中3例有表達(dá)，10例正常組織中2例有表達(dá)，表達(dá)率分別為42.2%、30.0%和20.0%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，宮頸癌組的E6APmRNA表達(dá)量高于正常組和CIN組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由此可知E6AP基因在正常和CIN組織中均有表達(dá)，但在癌性組織明顯增加。比較P53蛋白不同表達(dá)的組織中E6APmRNA的表達(dá)，P53陽(yáng)性宮頸癌組織中的表達(dá)（0.0957±0.0623）明顯高于陰性組織中的E6APmRNA表達(dá)（0.0072±0.0093），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 E6AP基因的表達(dá)與腫瘤的關(guān)系 根據(jù)腫瘤不同的臨床病理特征研究發(fā)現(xiàn)，臨床分期Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ期之間比較，Ⅲ期E6AP的表達(dá)水平明顯升高，具有顯著差異性（P<0.05）。而宮頸癌E6AP基因的表達(dá)在組織學(xué)分型、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各組間均無(wú)差異。

3 討 論

P53基因是細(xì)胞內(nèi)重要的腫瘤抑制基因和凋亡調(diào)節(jié)基因。當(dāng)P53突變時(shí)，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有研究表明P53蛋白過(guò)表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生，及分化程度關(guān)系密切[1]，在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。宮頸癌中p53蛋白功能失活主要是通過(guò)HPVE6，利用E6AP泛素依賴途徑降解的，同時(shí)也抑制P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[2]。本研究通過(guò)免疫組化及RT-PCR技術(shù)探討E6AP表達(dá)與P53的關(guān)系及其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的意義。研究表明，E6AP的表達(dá)與P53的表達(dá)關(guān)系密切，參與了宮頸上皮組織癌變的發(fā)生，并且在宮頸癌的發(fā)展中起重要作用。目前關(guān)于E6AP基因與宮頸癌的關(guān)系的研究大多處于對(duì)基礎(chǔ)的研究階段。本實(shí)驗(yàn)從mRNA水平研究了E6AP在不同宮頸組織的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，我們的研究認(rèn)為E6AP參與了宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，E6AP選擇性抑制劑可能會(huì)成為預(yù)防宮頸癌的一種新策略。

參考文獻(xiàn)

[1] 郎爽，孔繁斗，呂申，等.hMLH1、P27、P53 的表達(dá)及其在宮頸癌發(fā)病中的意義[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2006，18（6）：451- 453.

[2] Zanier K，Charbonnier S，Baltzinger M，et al.Kinetic analysis of the interactions of human PaPillomavirus E6 oncoProteins with the ubiquitin ligase E6AP using surface Plasmon resonance[J].J Mol Biol，2005，349（2）：401-413.