慢性乙型肝炎患者外周血骨橋蛋白水平及其臨床意義

【摘要】 目的 檢測(cè)慢性乙肝患者的外周血骨橋蛋白（OPN）水平，研究OPN與慢性乙肝的關(guān)系其臨床意義。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法檢測(cè)8例健康對(duì)照者和47例慢性乙型肝炎患者的外周血骨橋蛋白水平，觀察其在各組中的表達(dá)水平并探討其在慢性乙肝疾病發(fā)展中的意義。結(jié)果 所有慢性肝炎組外周血OPN水平均高于正常組，OPN水平隨肝臟炎癥程度加重而增高，與反映肝臟炎癥的生化指標(biāo)呈正相關(guān)，與乙肝病毒的復(fù)制無關(guān)。結(jié)論 測(cè)定骨橋蛋白水平變化可評(píng)估乙肝患者肝功能狀況及疾病的嚴(yán)重程度，對(duì)判斷乙肝患者預(yù)后有一定價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 骨橋蛋白；慢性乙肝；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

慢性乙肝是我國常見的慢性傳染病之一，同時(shí)也是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問題，全世界共約3.5億人感染乙肝病毒，且每年不斷有新發(fā)感染者，而感染HBV后一旦慢性化后，病情遷延不愈，經(jīng)過若干年后最終發(fā)展至肝硬化甚至肝癌，嚴(yán)重危害全人類的健康。然而，慢性乙型肝炎的致病環(huán)節(jié)仍未完全闡明，但病毒持續(xù)復(fù)制和機(jī)體免疫清除反應(yīng)是發(fā)病的主要因素。

骨橋蛋白（Osteopontin OPN）是一種帶負(fù)電的非膠原性骨基質(zhì)糖蛋白，由多種組織細(xì)胞合成與分泌，廣泛的分布于多種組織和細(xì)胞中，功能上具有細(xì)胞因子的特點(diǎn)，在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白是免疫細(xì)胞募集及啟動(dòng)Th1細(xì)胞免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，參與許多炎癥反應(yīng)的病理過程，與多個(gè)系統(tǒng)疾病發(fā)病有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)不同程度肝功損害的人外周血骨橋蛋白水平，探討其在慢性乙肝中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 55例患者取自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2009年4月-2010年1月間住院患者，其中單純慢性乙型肝炎且無肝硬化者35例（輕度16例，中度9例，重度10例），男性32例，女性3例，年齡范圍在17-70（平均年齡43.66±15.10）歲間，慢性重型乙型肝炎12例，男性10例，女性2例，年齡范圍在24-63（平均年齡47.83±14.27）歲間，正常對(duì)照組8例，男性5例，女性3例，年齡范圍在24-57（平均年齡36.63±10.50）歲間。慢性乙肝的診斷符合2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病分會(huì)、感染病分會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，6個(gè)月內(nèi)未接受過抗病毒治療，排除血清學(xué)檢測(cè)證實(shí)其他肝炎病毒感染或重疊感染者，排除非病毒感染如嗜酒、使用肝毒性藥物等引起的慢性肝炎或隱源性肝炎。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血樣 用清潔試管收集血液，抽血30分鐘后離心，1000×g15分鐘，收集血清，分裝后-20℃冷凍保存。

1.2.2 檢測(cè)外周血OPN 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法（ELISA）技術(shù)檢測(cè)。OPN試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，使用美國寶特BIO-TEK ELX800型酶標(biāo)儀檢測(cè)，各項(xiàng)操作均嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。

1.2.3 檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo) 采用常規(guī)方法檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、白蛋白、A/G比值、膽堿酯酶、凝血酶原時(shí)間等，PCR法檢測(cè)HBV-DNA載量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本均數(shù)間用t檢驗(yàn)或方差分析，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清骨橋蛋白水平比較 各組肝炎均高于正常組，與正常組比較存在顯著差異。組與組間的兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

2.2 將肝炎患者按輕度、中度、重度、重型分組，分別與正常組的骨橋蛋白進(jìn)行水平，除輕度組與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余組均高于正常組且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組與組比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

2.3 肝炎患者外周血骨橋蛋白水平與肝功能各個(gè)指標(biāo)之間的關(guān)系 骨橋蛋白與谷丙轉(zhuǎn)氨酶沒有相關(guān)性，與谷草轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、凝血酶原時(shí)間呈正相關(guān)，與膽堿酯酶、白蛋白、A/G比值呈負(fù)相關(guān)，見表3。

2.4 慢性乙肝外周血OPN水平與乙型肝炎病毒（HBV-DNA）、HBeAg之間的關(guān)系 結(jié)果提示HBV-DNA、HBeAg復(fù)制變化分組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表4。HBV-DNA復(fù)制水平分組之間也不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表5。

3 討 論

目前認(rèn)為HBV感染人體后出現(xiàn)的一系列改變與人體的免疫狀態(tài)有關(guān)，主要是由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷引起的。乙型肝炎病毒感染及慢性化過程中有多種免疫細(xì)胞通過直接殺傷和分泌細(xì)胞因子抑制病毒，間接導(dǎo)致肝細(xì)胞的損害，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。目前Th1/Th2細(xì)胞因子分泌失調(diào)和樹突狀細(xì)胞（DC）數(shù)量及功能低下是乙肝慢性化機(jī)制中報(bào)道比較多的。HBV感染后Th0細(xì)胞可在不同的信號(hào)刺激下分化成為Thl或Th2細(xì)胞。Thl細(xì)胞是促炎性T細(xì)胞，HBV感染后分泌細(xì)胞因子能增強(qiáng)NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及特異性的CTL等免疫細(xì)胞的活性，使免疫攻擊加強(qiáng)，清除病毒同時(shí)造成肝細(xì)胞損傷。HBsAg特異性的Th1細(xì)胞的缺陷導(dǎo)致HBV感染后中和性抗體的缺陷，使病毒不能被有效地清除，從而使HBV持續(xù)存在。Th2細(xì)胞則主要促進(jìn)體液免疫，HBV感染后輔助B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，中和胞外病原體。研究表明HBcAg免疫后IL-10表達(dá)增強(qiáng)，而產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細(xì)胞數(shù)量很少。體內(nèi)細(xì)胞因子IL-10的分泌增加可以拮抗Thl型細(xì)胞因子IL-2的分泌，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)病毒的細(xì)胞免疫功能減弱，造成病毒的持續(xù)感染。劉駿[1]報(bào)道HBV感染患者體內(nèi)Th1細(xì)胞的生物學(xué)功能及其細(xì)胞因子的產(chǎn)生均低下。慢性乙型肝炎病人外周血和肝臟中的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）產(chǎn)生IL-10的細(xì)胞比產(chǎn)生IFN-γ細(xì)胞明顯增多。這些均提示慢性乙肝以Th2應(yīng)答為主。DC將抗原提呈給未受抗原刺激的Th0細(xì)胞，同時(shí)分泌細(xì)胞因子IL-12等，調(diào)節(jié)Th0分化成Th1或Th2細(xì)胞。慢性乙型肝炎患者體內(nèi)DC功能明顯低下，不能將抗原的信號(hào)提呈給機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成患者體內(nèi)缺乏有效的CTL應(yīng)答，導(dǎo)致產(chǎn)生清除HBV效應(yīng)失敗，從而使患者HBV持續(xù)感染。慢性乙型肝炎的急性發(fā)作推測(cè)是Th1/Th2平衡的打破，Th1占優(yōu)勢(shì)，清除病毒的同時(shí)損傷肝細(xì)胞。邱慶明[2]研究證實(shí)慢性乙型肝炎急性發(fā)作時(shí)Th1細(xì)胞比例升高，與肝炎活動(dòng)程度呈正相關(guān)。唐克誠[3]對(duì)慢性重型乙型肝炎患者不同時(shí)期的Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同病情階段Th1與Th2反應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平不同，早期以IL-10分泌增多為主，晚期則以IFN-γ和IL-12水平大幅度提高為主。在肝炎活動(dòng)期分別補(bǔ)充IL-l0及IL-12，肝臟炎癥及病毒清除向不同的方向發(fā)展，IL-12明顯增強(qiáng)慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)HBeAg的應(yīng)答和產(chǎn)生IFN-γ。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，骨橋蛋白能促進(jìn)及調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)。在體外培養(yǎng)的小鼠巨噬細(xì)胞中加入OPN，48h后可檢測(cè)到高濃度的IL-12，而檢測(cè)不到IL-10；與OPN+/+小鼠相比，OPN-/-小鼠注入乙烯聚合吡咯烷酮（PVP）所誘導(dǎo)的IL-12表達(dá)低95%，IFN-γ低90%。這是因?yàn)椋菢虻鞍子址Q為早期T淋巴細(xì)胞活化因子Ⅰ，具有促趨化作用，能引起巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的遷移，在對(duì)抗感染的非特異性免疫及自身免疫中起一定作用。Higuchi Y[4]稱OPN能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的分化增殖，對(duì)CD8+T細(xì)胞能影響其遷移。Renkl等[5]證明OPN可以促進(jìn)人的DCs激活、遷移，并誘導(dǎo)DCs的人白細(xì)胞DR抗原、粘附分子表達(dá)，并且增強(qiáng)其共刺激能力。在混合淋巴反應(yīng)中，OPN促進(jìn)DCs分泌IL-12、TNF-α，并且誘導(dǎo)DCs向利于原始T細(xì)胞Th1極化的方向成熟。

早期是在四氯化碳引起的急性肝炎模型中發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白表達(dá)增高。Sahai A等[6]對(duì)非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的骨橋蛋白測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該小鼠骨橋蛋白水平和mRNA水平均增高。這些均提示在炎癥性肝病中骨橋蛋白表達(dá)增高，且與炎癥的嚴(yán)重程度有關(guān)。既往骨橋蛋白與肝炎的關(guān)系的研究主要來自中毒性肝炎、自身免疫性肝炎、酒精性肝炎等。對(duì)于慢性乙型肝炎與骨橋蛋白的關(guān)系的單獨(dú)研究則比較少。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了47例肝炎患者患者外周血骨橋蛋白水平，結(jié)果示總體慢性乙型肝炎組和慢性重型乙型肝炎組與正常組比較均高于正常組，且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分為慢性輕度、中度、重度、重型乙型肝炎，結(jié)果示除輕度肝炎組骨橋蛋白水平稍低于正常組水平且沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余組與正常組比較均高于正常組且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而且組與組間比較同樣存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，骨橋蛋白水平隨著肝炎嚴(yán)重程度增加呈增高趨勢(shì)，尤其慢性重型乙型肝炎組增高顯著。與文獻(xiàn)報(bào)道一致。Matsui A[7]證實(shí)暴發(fā)型肝炎患者的骨橋蛋白水平明顯高于急、慢性肝炎及健康人，II期肝性腦病及病程10天內(nèi)出現(xiàn)典型肝壞死者，骨橋蛋白水平升高更明顯。Arai M等[8]對(duì)暴發(fā)性肝衰竭和自限性肝炎患者血漿骨橋蛋白水平測(cè)定，發(fā)現(xiàn)前者明顯高于后者，均支持本研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)并對(duì)反映肝炎活動(dòng)的多個(gè)指標(biāo)與骨橋蛋白水平的關(guān)系進(jìn)行了進(jìn)一步研究，證實(shí)骨橋蛋白與谷草轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素、白蛋白、凝血酶原時(shí)間、膽堿酯酶等部分反映肝臟功能的指標(biāo)關(guān)系密切，肝臟炎癥分度越重，骨橋蛋白隨上述指標(biāo)損害加重有增高趨勢(shì)，與谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乙肝病毒載量無關(guān)。潘留蘭[9]等對(duì)乙型肝炎肝硬化患者外周血骨橋蛋白水平測(cè)定并分析提示慢性乙肝病毒感染性慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞因子骨橋蛋白水平變化相關(guān)，支持該實(shí)驗(yàn)結(jié)果。綜合上述資料認(rèn)為骨橋蛋白與肝炎的關(guān)系主要通過各種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子來起作用，尤其在重型肝炎中水平明顯增高，同時(shí)有報(bào)道[10]應(yīng)用骨橋蛋白的小干擾RNA（siRNA）可以減少刀豆蛋白A（Con-A）處理的小鼠肝壞死，那么在臨床中也許可以通過監(jiān)測(cè)骨橋蛋白水平的變化來判斷慢性乙肝向重型肝炎發(fā)展的傾向。

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