溫度與pH 值對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活力的影響

李 菊，王 瑋

（青島海洋科技館，山東 青島 266003）

水母是一類分布十分廣泛、種類眾多、數量及其龐大的海洋生物，以其絢麗的色彩、夢幻般的形態引起了人們的關注。關于水母飼養的餌料、光照和溫度等條件已摸索成熟[1-3]，但是在飼養過程中還是會遇到由于營養問題導致的碟狀體發育不全、水母成體傘徑過小、傘體外翻或游動動力不足等情況。為了更好地尋找水母適口餌料、增強營養攝入，需要全面了解水母消化酶理化性質，以分析水母更易消化吸收的營養成分。然而，目前關于水母消化酶的研究還處于初步階段，僅有僧帽水母（Physalia arethusa）、沙海蜇（Stomolophus meleagris）、海蜇（Rhopilema）和海月水母（Aurelia aurita）消化酶粗液的少量研究[4-6]，仍有大量水母的消化酶的理論研究亟待補充。

大西洋金黃水母（Chrysaora quinquecirrha），隸屬于 缽水母綱（Scyphozoa）、旗口水母目（Semaeostomeae）、游水母科（Pelagiidae）、金黃水母屬（Chrysaora）。該水母體色通常為乳白色或淺黃色，傘體直徑可達19 cm，觸手多且極細長，具有很高的觀賞價值，現已成為國內海洋館和水族館常規飼養的種類。試驗對大西洋金黃水母胃絲中的蛋白酶活性進行測定，初步研究了大西洋金黃水母胃絲蛋白酶對不同溫度的響應規律，以期為了解水母消化酶的生理生物學研究提供參考，也為水母飼養條件的優化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集試驗材料來自青島海產博物館水母缸，由同一批次大西洋金黃水母碟狀體發育形成。這些水母體傘徑為9.0 cm ± 1.0 cm，游動速度正常，形態完整，肉眼可見明顯胃絲，未發生排精或授精。

大西洋金黃水母飼養所用的海水為粗過濾處理的青島近岸天然海水，鹽度為33，pH 值約為8.0，控制水溫在22～24 ℃浮動。日常以鹵蟲無節幼體為水母 餌料。

1.1.2 主要儀器蛋白定量測試盒（南京建成科技有限公司）；恒溫培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司，LBI-250）；水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司，DK-8D）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備先將所有實驗用大西洋金黃水母集中放置于同一個水母培養箱中，饑餓處理24 h 以排除胃絲中殘存食物的影響。從水母缸中小心取出，轉移入實驗室內。將水母用0.22 μm 孔徑過濾的海水沖洗干凈，放入無菌的培養皿中，于解剖鏡下觀察胃絲的位置和生長狀況，之后迅速用1 000 μL 移液槍吸取胃絲組織。將胃絲組織轉移到到已低溫預冷的無菌勻漿器中。低溫研磨，并低溫離心15 min，吸取上清液，即得所需樣品。將樣品放置于冰板上保持低溫狀態以進行下一步試驗，其余樣品則分裝后長期保存于-80℃超低溫設備中。

1.2.2 蛋白酶活性的測定根據海月水母蛋白酶活力的試驗結果[6]，選取37 ℃、pH 8.0 為試驗條件，使用福林-酚試劑法[7]測定大西洋金黃水母的蛋白酶活性。

為定量光密度（OD）與樣品中的酪氨酸含量（μg）的線性關系，選用酶活力同樣的試驗條件測定梯度酪氨酸溶液的光密度，繪制酪氨酸曲線。

酪氨酸標準曲線方程：C=1 008×A-0.145。C 為樣品中酪氨酸含量，單位為μg，A 為OD 值。

蛋白酶活力（U）以單位時間（min）內酶提取液樣品產生酪氨酸的量（μg）表示。

使用蛋白定量測試盒并按照使用說明（考馬斯亮藍染色法），測定酶提取液樣品蛋白濃度（mg/mL）。計算方法：酶提取液樣品蛋白濃度（mg/mL）=（樣品OD 值-空白OD 值）/（標準品OD 值-空白OD 值）×標準品濃度（5 mg/mL）

經計算可得，酶提取液樣品蛋白濃度為0.968 mg/mL。

酶提取液樣品的蛋白酶活力以單位毫克的蛋白質所具有的酶活力表示，稱之為比活力，單位為（U/mg）。

解析：安裝螺口燈座時，由于螺旋套是裸露的，人容易與它接觸，故只能接在零線上才能保證安全；開關是控制電路通斷的裝置，在照明電路中，雖然不論是接在零線上還是火線上都能起到控制作用，但若接在了零線上，開關斷開后，燈頭里還會帶電，是不安全的。

以時間（min）橫坐標，比活力（U/mg）為縱坐標，繪制反應進程曲線。

1.3 溫度和pH 值對酶活力影響的測定

在溫度對酶活力影響的實驗中，通過恒溫培養箱控制酶反應溫度為4、15、25 ℃，通過水浴鍋控制反應溫度為37、50、60 ℃。

在pH 值對酶活力影響的實驗中，將反應溫度設置為酶活力最高溫度，實驗pH 值設置為6.5～9.5，組距設置為0.5。使用磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉配制pH值≤8.0 的緩沖液，使用碳酸鈉和碳酸氫鈉配制pH值≥8.5 的緩沖液。

按照福林-酚試劑法[7]測定不同條件下的樣品的酶活力。

2 結果與分析

2.1 大西洋金黃水母胃絲蛋白酶反應進程曲線

由反應進程曲線（圖1）可知，在15 min 內樣品蛋白酶活力隨時間線性增加，而15～20 min 內，樣品蛋白酶活力增加的速度略有減緩，超過20 min 后酶活力增加幅度非常小，可能是由于反應物（酪蛋白）濃度下降等原因產生的。為了排除反應時間對酶活力的干擾，選定15 min 作為試驗的酶反應時間。

圖1 大西洋金黃水母胃絲蛋白酶反應進程曲線

2.2 反應溫度對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活性的影響

由圖2 可知，大西洋金黃水母胃絲蛋白酶的最適溫度是50℃。試驗結果表明，在4～60 ℃大西洋金黃水母胃絲中蛋白酶都具有活力，而且溫度對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活力影響非常顯著；在溫度相對較低時（4～15 ℃），大西洋金黃水母胃絲蛋白酶維持在較低活力，其中10 ℃條件下蛋白酶活力相對4 ℃和15 ℃條件下的值略低；在25～50 ℃時蛋白酶活力急劇升高，在50 ℃時達到最高，隨后又隨溫度提升而急速下降。

圖2 不同溫度條件對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活性的影響

2.3 不同pH 值對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活性的影響

由圖3 可知，在pH 值6.5～9.5 條件下大西洋金黃水母胃絲蛋白酶均具有活性，且pH 值對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活力具有顯著影響。pH 值為8.5 條件下蛋白酶具有最大的酶活力，即蛋白酶的最適pH值為8.5，之后酶活力向兩側遞減，其中越接近最適pH 值遞減幅度越大。

圖3 不同pH 值對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活性的影響

3 結論與討論

3.1 溫度對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活力的影響

試驗結果表明，大西洋金黃水母胃絲蛋白酶受溫度變化影響非常顯著，這與宋晶等[5]對海哲蛋白酶的研究結果一致。蛋白酶的主要組成成分是蛋白質，在低溫情況下活力會變弱，隨溫度升高反應速度逐漸變快，而在過高的溫度條件下，會發生蛋白質變性導致酶活力下降甚至完全沒有活性。從試驗結果可以看出，無論是低溫4 ℃，還是高溫50 ℃，均能監測到大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活性，說明水母對溫度的適應范圍很廣。大西洋金黃水母從新英格蘭南部海岸到熱帶地區均被發現過，表明其溫度適應范圍較寬，部分水母會在極端條件下生存下來，也與這一結果相吻合。

大西洋金黃水母胃絲蛋白酶的最適溫度50 ℃高于飼養水溫（22～24 ℃），與其他很多海洋生物有關的研究結論相似[8-10]。由日常飼養經驗可知，當水溫超過27 ℃時，水母會發生傘體畸形、回縮、游動速度變慢，甚至死亡，可能是溫度過高導致機體蛋白質變性。因此，為了保持良好的形體以及較高的消化速率，應當維持飼養溫度在24～25 ℃。

在胃絲蛋白酶的最適溫度的比較上，相比于海蜇（42 ℃）[5]和海月水母（37 ℃）[6]，大西洋金黃水母 的最適溫度明顯較高（50 ℃），但是與海蜇的絲狀附著器以及某些魚類的胃蛋白酶[11]最適溫度相接近，這表明大西洋金黃水母的胃絲蛋白酶組成成分與海月和海蜇有明顯不同。雖然3 種水母胃絲蛋白酶的最適溫度不同，但是它們在相對于溫度的反應規律大體一致，即低溫時蛋白酶活力較低，隨溫度的升高而逐漸升高，在最適溫度達到最大隨后迅速下降，有且僅有一個酶活力峰值。這表明，3 種水母胃絲蛋白酶均由幾種理化性質相近的蛋白質組成。

3.2 pH 值對大西洋金黃水母胃絲蛋白酶活力的影響

在研究中，大西洋金黃水母胃絲蛋白酶在pH 值 6.5～9.5 條件下均具有較高的活性，與水母適應海水大范圍pH 值的現象相吻合[12-13]。在最適溫度50 ℃條件下，大西洋金黃水母在堿性條件下具有較高酶活力（8.0～9.0），由此可推測大西洋金黃水母消化酶中可能含有堿性蛋白酶。由于水母體腔與外界相通，大西洋金黃水母胃絲蛋白酶實際作用pH 值更接近海水pH 值8.0，略低于酶的最適pH 值。但是酶的最適pH值并不是一成不變的，而是受到溫度、其他蛋白質等可溶性有機物大分子、緩沖液離子等多種因素影響。當反應液溫度降低，蛋白酶的最適pH 值也會隨之變 低[14-16]。試驗的反應條件與實際條件有著明顯差別，例如，飼養溫度近似23 ℃，遠低于試驗溫度50 ℃、以磷酸鹽溶液為緩沖液等。因此，大西洋金黃水母飼養條件下的最適pH 值未必與蛋白酶的最適pH 值完全一致。

有研究表明，海蜇、沙海蜇以及僧帽水母的蛋白酶隨pH 變化呈現出兩個峰值[4-6]，表明它們均同時含有酸性和堿性蛋白酶。由于酸性pH 值條件下酶活力數據有限，暫時不能排除大西洋金黃水母胃絲中具有酸性蛋白酶，使其在較低pH 值條件下具有較高的酶活力。與多種水母的堿性蛋白酶最適pH 值相比，大西洋金黃水母的胃絲蛋白酶最接近海月水母（pH 值8.5），高于沙海蜇和僧帽水母（pH 值7.3～7.6），低于海蜇（pH 值9）[4-6]。這說明大西洋金黃水母可能具有與海月水母相同的堿性蛋白酶。