柱穗山羊草α—醇溶蛋白基因的克隆與序列分析

摘 要：根據(jù)已知的普通小麥α-醇溶蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法克隆基因并進(jìn)行序列分析。從柱穗山羊草Y127中克隆得到1個(gè)α-醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2，它具有α-醇溶蛋白基因的典型結(jié)構(gòu)特征，編碼區(qū)全長(zhǎng)939 bp，編碼313個(gè)氨基酸。氨基酸序列比較顯示，Gli2-Z-2在多聚谷氨酰胺區(qū)比已報(bào)道的α-醇溶蛋白序列有較多的谷氨酰胺殘基。

關(guān)鍵詞：柱穗山羊草；α-醇溶蛋白基因；基因克隆；序列分析

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）10-0007-04

小麥籽粒的加工品質(zhì)受多種因素影響， 其中籽粒貯藏蛋白的組成和含量起重要作用[1]。小麥籽粒貯藏蛋白的主要組成成分是麥醇溶蛋白和麥谷蛋白， 其中醇溶蛋白是胚乳中產(chǎn)生的小麥種子儲(chǔ)藏蛋白的主要類型，與面團(tuán)特性高度相關(guān)[2，3]，在組成上以單體形式存在，具有高度的異質(zhì)性和復(fù)雜性[4]，富含脯氨酸和谷氨酰胺，對(duì)面團(tuán)物理特性有重要作用[5]。根據(jù)在SDS-PAGE上的遷移率可將醇溶蛋白分為α、β、γ 和ω 4 類，除ω-醇溶蛋白沒(méi)有半胱氨酸（Cys）不能形成二硫鍵外，其余均能形成分子內(nèi)二硫鍵。α-麥醇溶蛋白多肽富含硫，分子量約為30～45 ku，由第6 部分同源染色體短臂上的Gli-2位點(diǎn)編碼，而其余小麥醇溶蛋白基因位于第1部分同源染色體短臂上[6]。在4種醇溶蛋白類群中，α-醇溶蛋白含量最豐富，占小麥種子儲(chǔ)藏蛋白的15%～30%，是人類消費(fèi)量最大的蛋白質(zhì)。

柱穗山羊草（Ae.cylindrica Host，CCDD， 2n=x=14） ， 屬于禾本科（Poaceae） 小麥族（Triticeae Dumort） 山羊草屬（Ae. gilops L.） 柱穗山羊草組（Cylindropyrum），分布在法國(guó)南部、意大利、南斯拉夫、匈牙利、羅馬尼亞、保加利亞、阿爾巴尼亞、希臘、俄羅斯南部、阿富汗、伊朗、伊拉克北部、土耳其和敘利亞。由粗山羊草與尾狀山羊草天然雜交進(jìn)化而來(lái)， 由于長(zhǎng)期的自然進(jìn)化， 蘊(yùn)涵大量遺傳資源， 是小麥育種材料的補(bǔ)充[7]。由于α-醇溶蛋白基因的克隆在柱穗山羊草中報(bào)道較少，本研究旨在從柱穗山羊草中分離α-醇溶蛋白基因，并對(duì)其進(jìn)行序列分析，研究α-醇溶蛋白在小麥及其近緣屬種中的進(jìn)化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為柱穗山羊草Y127，由中國(guó)國(guó)家種質(zhì)庫(kù)提供。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 植物總DNA的提取采用CTAB法[8]。

1.2.2 PCR 引物設(shè)計(jì)和基因組DNA擴(kuò)增 根據(jù)已報(bào)道的α-醇溶蛋白基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)可擴(kuò)增α-醇溶蛋白基因完整編碼區(qū)的引物：正向引物PF（5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG-3′）和反向引物PR（5′-TCAGTTA/GGTACCG/AAAGATGCC-3′，“/”表示簡(jiǎn)并），分別位于醇溶蛋白基因編碼區(qū)的起始端和終止端。PCR 反應(yīng)總體積為50 μl，其中含10×buffer 5 μl、1.5 mmol/L MgCl2、4種dNTP各200 μmol/L、引物各150 ng、Taq plus DNA polymerase（高保真）1.5 U、基因組DNA 100 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min；然后94℃變性45 s，63.8℃退火1 min，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物回收純化、T-載體克隆與陽(yáng)性克隆篩選 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，將目的片段回收純化后連接到pEASY-T1載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。對(duì)白色菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確認(rèn)陽(yáng)性克隆。

1.2.4 序列測(cè)定與比較分析 DNA測(cè)序由華大基因公司完成，序列分析利用NCBI 網(wǎng)站和DNAman進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增、目的片段回收與克隆

用引物PF、PR對(duì)Y127基因組總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1%瓊脂糖凝膠上分離，檢測(cè)出一條900 bp左右的帶。將目的片段回收純化后，連接到pEASY-T1載體上。對(duì)白斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確認(rèn)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行測(cè)序，得到1個(gè)新的基因序列，命名為Gli2-Z-2（圖1）。

2.2 Gli2-Z-2核苷酸序列分析

將從Y127中克隆得到的醇溶蛋白基因序列Gli2-Z-2在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行核苷酸序列檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與已知醇溶蛋白基因序列存在較高的相似性，相似度在80%左右。Gli2-Z-2的完整編碼區(qū)全長(zhǎng)為939 bp，可翻譯成含313個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。

2.3 Gli2-Z-2氨基酸序列分析

對(duì)于Gli2-Z-2氨基酸結(jié)構(gòu)而言，包含由20個(gè)氨基酸殘基組成的相對(duì)保守的信號(hào)肽（MKTFLILALLAIVATTATTA），隨后是由5個(gè)串聯(lián)重復(fù)短肽（12肽）組成富含谷氨酰胺和脯氨酸的N端重復(fù)區(qū)，多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)和特征區(qū)Ⅰ、多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)和特征區(qū)Ⅱ，具有典型的α-醇溶蛋白序列的特點(diǎn)。

將克隆到的Gli2-Z-2基因與從NCBI網(wǎng)站上檢索到的8個(gè)α-醇溶蛋白基因進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析（圖2），結(jié)果顯示：8個(gè)α-醇溶蛋白基因分別來(lái)源于栽培一粒小麥（ACJ76944）、烏拉爾圖小麥（AFF27491）、野生二粒小麥（AFH74446、AFH74439、 AFH74444、AAZ73729）、單芒山羊草（AEW46744）和粗山羊草-黑麥雜種后代（AFD33733），與其它α-醇溶蛋白的N端重復(fù)區(qū)相比，在Gli2-Z-2的56、76、78位上分別為Q（谷氨酰胺）、P（脯氨酸）、P（脯氨酸），其余基因在這幾個(gè)位點(diǎn)上則分別為P（脯氨酸）、L（亮氨酸）、L（亮氨酸）。在所比較的9個(gè)序列中，重復(fù)區(qū)差異較大的為AEW46744和AFD33733，較其他序列分別有一段額外的QLLYPQP和QLPYPQL序列。在多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)，Gli2-Z-2 較其他序列多PISQ四個(gè)氨基酸殘基；而在多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)，Gli2-Z-2則比AEW46744多出10個(gè)Q（谷氨酰胺），比其他序列多12個(gè)Q（谷氨酰胺）。另外，在特征Ⅱ區(qū)，Gli2-Z-2比其他序列多出ST兩個(gè)氨基酸殘基。

注：ACJ76944，栽培一粒小麥；AEW46744，單芒山羊草；AFD33733，粗山羊草-黑麥的雜種后代；

AFF27491，烏拉爾圖小麥；AAZ73729、AFH74439、AFH74444、AFH74446，野生二粒小麥。下圖同。

2.4 α-醇溶蛋白序列聚類分析

將從柱穗山羊草中得到的α-醇溶蛋白序列與其他α-醇溶蛋白序列進(jìn)行同源聚類分析發(fā)現(xiàn)，各序列間變異較小，可劃分為兩類，Gli2-Z-2未與其他α-醇溶蛋白聚為一類，而是單獨(dú)一類（圖3）。聚為一類的基因大多來(lái)源于相同的物種或含有相同基因組的不同物種，由此可以看出，醇溶蛋白基因是隨物種的進(jìn)化或者染色體組的進(jìn)化一同進(jìn)化的。

小麥族植物種子醇溶蛋白位點(diǎn)上存在大量的等位性變異， 已被廣泛運(yùn)用于品種鑒定、遺傳資源評(píng)價(jià)和遺傳多樣性分析[9，10]。對(duì)不同類型的醇溶蛋白基因結(jié)構(gòu)的解析發(fā)現(xiàn)，它們均具有保守的結(jié)構(gòu)， 因而有利于對(duì)種子醇溶蛋白家系進(jìn)行分離與序列分析工作。本研究根據(jù)已報(bào)道的α-醇溶蛋白基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)可擴(kuò)增α-醇溶蛋白基因完整編碼區(qū)的引物， 從柱穗山羊草中克隆到了一個(gè)α-醇溶蛋白基因。該基因與已克隆的α-醇溶蛋白基因存在較大差異，尤其是較其他序列在多聚谷氨酰胺區(qū)多出10～12個(gè)谷氨酰胺殘基。聚類分析發(fā)現(xiàn)，α-醇溶蛋白基因的進(jìn)化與其來(lái)源關(guān)系密切，其進(jìn)化可能是伴隨著基因組的進(jìn)化同時(shí)進(jìn)行的。由于該基因未與其他基因聚為一類，推測(cè)該基因可能來(lái)源于C基因組，該推測(cè)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

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