兔脛骨骨膜下注射轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1和β2促進骨膜生發(fā)層細胞增殖的研究

荊立忠 胡 躍林 郭秦煒 張繼英

（北京大學第三醫(yī)院運動醫(yī)學研究所，北京 100191）

骨膜由纖維層和生發(fā)層兩部分構(gòu)成，生發(fā)層含有大量干細胞，在特定環(huán)境下可分化為軟骨細胞。骨膜移植作為修復軟骨缺損的常見術(shù)式之一已有多年歷史［1，2］，其主要優(yōu)點在于操作簡單、可以整體移植等。但隨著年齡的增長，骨膜生發(fā)層厚度及干細胞數(shù)量會逐漸減少［3］，是導致骨膜移植修復軟骨損傷效果不佳的原因之一。促進骨膜生發(fā)層干細胞的增殖，增強其成軟骨能力，成為移植前要解決的重要問題。大量實驗已證實，轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β具有促進干細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞分化等作用。在骨膜移植前通過微量注射器局部注射TGF以促進骨膜生發(fā)層細胞增殖具有微創(chuàng)、作用直接等優(yōu)點。本實驗通過比較單次注射TGFβ1或TGFβ2對骨膜生發(fā)層細胞增殖效應的異同，初步探討促進骨膜生發(fā)層細胞增殖的可行性及規(guī)律，以期提高成年動物骨膜生發(fā)層細胞的成軟骨能力。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

4月齡的成年新西蘭大白兔22只，（3.0±0.5）kg，雌雄不限（北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供，許可證編號：SCXK京2011－0008）。

實驗材料：Hamilton微量注射器（容量10μl，針頭30 gauge）為瑞士Hamilton公司生產(chǎn)；TGFβ1與TGFβ2為美國 Peprotech公司生產(chǎn)（catalog：100－21；100－35）。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計與操作 沿兔耳緣靜脈緩慢推注20％烏拉坦全身麻醉，術(shù)前肌注1 ml氯胺酮。以脛骨結(jié)節(jié)最高點為骨性標志，在其內(nèi)側(cè)5 mm處做一5 mm的縱行皮膚切口，勿傷及深層組織，使用微量注射器于脛骨結(jié)節(jié)最高點內(nèi)側(cè)5 mm注射一針，于第一針以遠5 mm處注射第二針（圖1）。將大白兔分為3組：①對照組，于兩位置分別注射10μl Tris溶液（Tris pH=8.0，Sigma公司）；②TGFβ1 實驗組：于兩位置分別注射20 ng（10 μl）TGFβ1；③TGFβ2實驗組：于兩位置分別注射20 ng（10μl）TGFβ2。

圖1 示注射部位

2個實驗組各8只兔，對照組6只，每組兩側(cè)脛骨均納入操作。TGFβ1組：首先對全部8只兔的左側(cè)脛骨進行注射操作，于第3天對其中4只右側(cè)脛骨進行注射操作，第5天處死，從而得到3天、5天兩個時間點的標本；于第4天對另外4只右側(cè)脛骨進行注射操作，第10天處死，從而得到7天、10天兩個時間點的標本。對照組和TGFβ2組操作與TGFβ1組相同，只是對照組每次3只。大體觀察后取脛骨近端附帶骨膜的骨皮質(zhì)標本做組織學切片（每塊標本包含2個注射點），這樣實驗組的每個時間點即可獲得8個觀察數(shù)據(jù)，對照組為6個。

1.2.2 大體觀察 術(shù)后第3天、5天、7天、10天將全部兔通過注射過量烏拉坦處死，分離脛骨近端內(nèi)側(cè)骨膜表面深筋膜等軟組織，大體觀察各組注射位置骨膜的增生、腫脹情況。

1.2.3 標本的處理 用骨刀切取脛骨近端附帶骨膜的骨皮質(zhì)標本（包含2個注射點），面積約10 mm×10 mm，修切整齊，立即浸入4％多聚甲醛固定24小時，生理鹽水沖洗，然后放入10％甲酸脫鈣液脫鈣5～7天，將標本切成兩塊（每塊包含1個注射點），石蠟包埋后切片，厚度5μm。

1.2.4 組織化學染色及顯微鏡下觀察 將各組標本切片脫蠟，進行HE染色。應用Image－Pro PLUS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對標本進行成像，低倍鏡放大200倍，測量生發(fā)層厚度（μm）、計算細胞密度（×104/cm2）；高倍鏡放大400倍，觀察細胞大體形態(tài)。為保證結(jié)果可靠，測量3次取平均值。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，多組之間采用單因素方差分析檢驗進行比較，兩兩之間比較采用LSD。P＜0.05表示差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

大體觀察各組注射部位，與外周相比，2個實驗組5天、7天時間點的注射部位略顯腫脹，間或見注射器刺激骨膜后形成的微血管網(wǎng)。2個實驗組3天、10天及對照組僅可見微血管網(wǎng)，無明顯腫脹。各組骨膜注射部位表面均有光澤。

低倍鏡下觀察，骨膜分為兩層：淺層纖維層膠原纖維排列緊密，細胞呈長梭形，細胞數(shù)量少；深層（即生發(fā)層）細胞呈圓形或橢圓形，細胞數(shù)量相對較多。

各組不同時點生發(fā)層厚度比較（表1）：對照組注射后各時點差異無顯著性（P＞0.05）；TGFβ1組和TGFβ2組注射后第5天生發(fā)層厚度較第3天明顯增加，最大厚度均出現(xiàn)在注射后第7天（P＜0.05），注射后第10天與第3天差異無顯著性（P＞0.05）。3組間生發(fā)層厚度比較（表 1）：注射后第3天、第10天差異無顯著性（P＞0.05）；注射后第5天、第7天TGFβ1和 TGFβ2組均明顯高于對照組，且注射后第5天TGFβ2組厚度明顯大于TGFβ1組（P=0.017）。細胞密度比較（表 1）：3組注射后不同時點以及3組間差異均無顯著性（P＞0.05）。

表1 注射TGFβ1和TGFβ2后不同時間段生發(fā)層厚度、細胞密度的比較

高倍鏡下觀察，對照組（圖2a）生發(fā)層細胞核呈橢圓形，藍色深染，細胞數(shù)較少。TGFβ1組注射第3天（圖2b）、第10天（圖2e）與對照組生發(fā)層細胞形態(tài)類似，第7天（圖2d）骨膜生發(fā)層細胞增殖顯著，胞核增大呈圓形或橢圓形，藍色深染，胞漿基質(zhì)豐富，細胞數(shù)目多。TGFβ2組第3天（圖2 f）、第10天（圖2i）生發(fā)層細胞形態(tài)與 TGFβ1組第3天（圖2b）、第10天（圖2e）類似，第5天（圖2g）與第7天（圖2h）細胞形態(tài)與 TGFβ1第7天（圖2d）類似。

圖2 注射TGFβ后不同時間點骨膜HE染色 A為空白對照組（×200）；B～E分別為注射TGFβ1后第3天、5天、7天、10天組（×200）；F～I分別為注射 TGFβ2后3天、5天、7天、10天組（×200）；右上角 a～i分別為放大400倍圖像

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復一直是運動醫(yī)學及骨關(guān)節(jié)外科研究的難點及重點。利用骨髓、脂肪組織等來源的干細胞修復軟骨損傷的實驗室研究顯示了較滿意的結(jié)果，但由于需進行體外培養(yǎng)、二次手術(shù)與污染風險等因素限制了其在臨床上的應用。將骨膜應用于各種軟骨缺損的修復已有多年歷史［1，2］。其主要優(yōu)點在于可以整體移植，同時包含干細胞和各種細胞因子，無需體外培養(yǎng)，從而更加簡單易行。骨膜生發(fā)層干細胞在一定條件下可以分化為軟骨細胞，但隨年齡增長，其增殖分化潛能會逐漸下降［3］。因此，對于成年患者，其自身骨膜很難在細胞數(shù)量及密度上達到移植的標準［4］，這就有必要提高骨膜生發(fā)層干細胞的數(shù)量，從而提高骨膜的軟骨修復能力。近年大量實驗研究探討了不同細胞因子對細胞增殖分化的影響，并且證實TGFβ具有促進細胞增殖、調(diào)節(jié)細胞分化等作用［5，6］。

本實驗證實，單次注射TGFβ時細胞的增殖是短暫的、一過性的。這一結(jié)論與Reinholz等［7］的研究類似。Reinholz等觀察到向成年大白兔脛骨骨膜下單次注射TGFβ1后可以刺激骨膜生發(fā)層細胞增殖。其最大效應出現(xiàn)在注射后第7天，表現(xiàn)為生發(fā)層厚度最大，細胞數(shù)目最多。不同之處在于本實驗第3天實驗組與對照組相比雖略有增加，但并無明顯差異。此外，本研究2個實驗組注射后10天與對照組也無明顯差別。這就進一步提示干預后間隔時間的長短將影響到骨膜生發(fā)層的增殖，時間過長或過短均達不到理想的效果。單次注射不同于連續(xù)注射，后者往往可以誘導軟骨細胞生成［8，9］，但也容易導致骨組織的生成［8］，因此并不利于軟骨缺損的修復。本研究表明，在TGF的干預下，骨膜生發(fā)層細胞（包括干細胞）會出現(xiàn)一過性增殖。在此時間段上，如果將TGF誘導的骨膜移植到關(guān)節(jié)內(nèi)，保持持續(xù)性的刺激及適宜的微環(huán)境，則可能促進骨膜生發(fā)層細胞進一步向軟骨分化。

不同TGFβ亞型對不同的細胞或組織效應各異［8］。本實驗比較了骨膜下單次注射 TGFβ1和TGFβ2后對生發(fā)層細胞增殖效應的異同。結(jié)果顯示單次注射兩者后生發(fā)層細胞數(shù)量均會一過性增加，并且TGFβ2對生發(fā)層細胞的增殖效應更為明顯。多數(shù)研究是通過幼年動物［8，9］或體外［10］進行的，結(jié)果雖然也證明兩者可以促進生發(fā)層細胞的增殖和分化，并且TGFβ2誘導軟骨細胞分化的能力強于 TGFβ1，但成年動物體內(nèi) TGFβ1和TGFβ2 促生發(fā)層細胞增殖效應的異同尚無研究報道。本實驗中TGFβ2的促增殖效應之所以相對較好，原因可能在于 TGFβ2可以誘導合成TGFβ1［8］，兩者共同作用于生發(fā)層細胞產(chǎn)生協(xié)同效應，從而導致更為明顯的增殖效應。Pombo-Suarez等［11］觀察到在骨性關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細胞內(nèi)，TGFβ1與TGFβ2的基因表達存在強烈的相關(guān)性，從而更進一步證實了這種可能性。

本文的不足之處在于沒有對生發(fā)層細胞的性質(zhì)做鑒定，畢竟生發(fā)層內(nèi)包括成骨細胞、骨原細胞、成纖維細胞、纖維細胞等較多的細胞成分。因此，注射TGFβ后增殖細胞的性質(zhì)，還有待于通過流式細胞技術(shù)對其細胞表面標志物如 CD90、CD105 等［12，13］進行進一步的驗證。此外，本實驗雖然初步確定了注射TGFβ后生發(fā)層細胞增殖的時間窗，觀察到注射后時間過短或過長增殖效應均不明顯，但對于注射生長因子更長時間后生發(fā)層細胞的變化還有待于進一步研究。

1 Emans PJ，Surtel DA，F(xiàn)rings EJ，et al.In vivo generation of cartilage from periosteum.Tissue Eng，2005，11（3 －4）：369 －377.

2 O’Driscoll SW，F(xiàn)itzsimmons JS.The role of periosteum in cartilage repair.Clin Orthop Relat Res，2001，391（Suppl）：S190－S207.

3 O’Driscoll SW，Saris DB，Ito Y，et al.The chondrogenic potential of periosteum decreases with age.JOrthop Res，2001，19（1）：95 －103.

4 Jansen EJ，Emans PJ，Guldemond NA，et al.Human periosteumderived cells from elderly patients as a source for cartilage tissue engineering？JTissue EngRegen Med，2008，2（6）：331 －339.

5 Mara CS，Sartori AR，Duarte AS，et al.Periosteum as a source of mesenchymal stem cells：the effects of TGF-beta3 on chondrogenesis.Clinics（Sao Paulo），2011，66（3）：487 －492.

6 Olivos-Meza A，F(xiàn)itzsimmons JS，Casper ME，et al.Pretreatment of periosteum with TGF-beta1 in situ enhances the quality of osteochondral tissue regenerated from transplanted periosteal grafts in adult rabbits.Osteoarthritis Cartilage，2010，18（9）：1183 －1191.

7 Reinholz GG，F(xiàn)itzsimmons JS，Casper ME，et al.Rejuvenation of periosteal chondrogenesis using local growth factor injection.Osteoarthritis Cartilage，2009，17：723 －734.

8 Joyce ME，Roberts AB，Sporn MB，et al.Transforming growth factorbeta and the initiation of chondrogenesis and osteogenesis in the rat femur.JCell Biol，1990，110（6）：2195 －2207.

9 Critchlow MA，Bland YS，Ashhurst DE.The effects of age on the response of rabbit periosteal osteoprogenitor cells to exogenous transforming growth factor-beta 2.J Cell Sci，1994，107（Pt 2）：499－516.

10 Barry F，Boynton RE，Liu B，et al.Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow：differentiation-dependent gene expression of matrix components.Exp Cell Res，2001，268（2）：189－200.

11 Pombo-Suarez M，Castano-Oreja MT，Calaza M，et al.Differential upregulation of the three transforming growth factor beta isoforms in human osteoarthritic cartilage.Ann Rheum Dis，2009，68（4）：568 －571.

12 Csaki C，Matis U，Mobasheri A，et al.Chondrogenesis，osteogenesis and adipogenesis of canine mesenchymal stem cells：a biochemical，morphological and ultrastructural study.Histochem Cell Biol，2007，128（6）：507－520.

13 Adesida AB，Mulet-Sierra A，Jomha NM.Hypoxiamediated isolation and expansion enhances the chondrogenic capacity of bone marrow mesenchymal stromal cells.Stem Cell Res Ther，2012，3（2）：9 －20.