大腸癌FHIT和CHFR基因甲基化狀態分析

王玉軍，徐 峰

(鄭州大學第一附屬醫院消化內科 河南鄭州 450052)

大腸癌是消化道腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，發病率居全球腫瘤的第3位，死亡率占所有腫瘤的9%，且往往確診時已經發展至中晚期，治療效果及預后較差。因此，探索其在分子水平的發生、發展機制，尋找早期診斷和早期治療的方法很關鍵。近年來人們認識到表觀遺傳修飾也參與腫瘤的形成。DNA的甲基化是發現最早的基因表觀遺傳修飾方式之一［1］，異常甲基化可能導致基因失活，業已發現多個基因的異常高甲基化在結直腸癌中頻繁發生。脆性組氨基酸三聯(FragiIe Histidine Triad，FHIT)基因是第一個將脆性位點與腫瘤相聯系的侯選抑癌基因。研究發現:“FHIT基因作為抑癌基因，其啟動子區在多種腫瘤中處于高甲基化狀態”［2-3］。CHFR(Checkpoint with FHA and Ring Finger)是2000年新發現的一種能夠檢測分裂期正常細胞的分裂情況及控制分裂進行的基因，是一個新發現的抑癌基因，是第1個被發現的有絲分裂前期的檢測點。CHFR在正常組織中廣泛表達，其結構和功能都十分保守。研究表明，在結腸癌［4-5］、白血病［6］、胃［7-8］、乳腺癌［9］等多種腫瘤組織中 CHFR 表達缺失，CpG島的甲基化可以導致CHFR表達缺失或沉默，但在大腸癌中的研究卻鮮見報道。本研究利用甲基化特異性PCR檢測46例大腸癌及相應癌旁正常組織中FHIT和CHFR基因的甲基化狀態，目的在探討其與大腸癌發生發展的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2011年7月至2013年10月鄭州大學第一附屬醫院手術切除的大腸癌標本及相應的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)共計46例，所有標本的診斷均經病理學教研室檢查，且術前均未行免疫治療及放化療，其中男25例，女21例，年齡36～79歲，平均55歲，有淋巴結轉移者27例，無淋巴結轉移者19例;按腫瘤部位分類，直腸癌17例，結腸癌29例;按組織學分級，高、中分化者20例，中低、低分化者26例;按Dukes分期，A+B期30例，C+D期16例。所有標本離體后立即凍于液氮中，快速取出后置于－80℃冰箱中保存待測。Epitect Bisulfite Kit購自QIAGEN公司;TIANamp Genomic DNA Kit、PCR所需試劑均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MSP方法原理:采用甲基化特異性 PCR方法，將從標本中提取的DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，使甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而未甲基化的DNA中胞嘧啶則不發生改變，根據修飾過的DNA片段設計DNA引物，并進行PCR擴增，根據DNA產物片段大小的不同檢測出差異，從而判斷組織中DNA是否甲基化。

1.2.2 基因DNA提取:取－80℃保存的冷凍組織50～80 mg，按照組織DNA提取試劑盒說明書提取組織DNA，應用紫外分光光度法測定DNA的純度及濃度，于－20℃保存。

1.2.3 基因DNA修飾及純化:取1 μg上存DNA，按照EpiTect Bisulfite Kit試劑盒說明書進行亞硫酸氫鈉修飾及純化，最后溶于40 μl EB溶液中。

1.2.4 PCR擴增:由上海生工生物工程有限公司設計合成引物，見表1。PCR反應體系為25 μl，包括修飾后的模板 DNA 2 μl，5 × buffer(100 mmol/L Tris，HCl 500 mmol/L，KCl 15 mmol/L，MgCl2)5 μl，上、下游引物各 0.5 μl(10 pLmol/L)、Taq 多聚酶0.125 μl、dNTP Mixture 2.5 μl。反應條件:95 ℃預變性 10 min，95℃1 min，退火(FHIT為66℃，CHFR為50℃)1 min，72℃1 min，進行35個循環，最后72℃延伸10 min。取5 μl PCR產物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳并攝像分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件處理，應用χ2檢驗或Fisher確切概率法、關聯分析法分析數據，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MSP檢測基因甲基化狀態 FHIT和CHFR基因在大腸癌中的甲基化率(54.35%、34.78%)分別高于在癌旁正常組織中的甲基化率(8.69%、2.17%)，組間差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表2、表3。

表1 FHIT和CHFR基因MSP引物序列和產物大小

表2 大腸癌及正常組織中FHIT基因甲基化

2.2 分析大腸癌中FHIT和CHFR基因甲基化的相關性 大腸癌中FHIT和CHFR基因甲基化有相關性(r=0.393，P ＜0.05)。見表 4。

表4 大腸癌FHIT和CHFR基因甲基化間相關性

2.3 FHIT和CHFR基因甲基化與臨床病理特征的關系 FHIT和CHFR基因甲基化與分化程度、淋巴結轉移有顯著相關性(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤部位、Dukes分期無顯著相關性(P＞0.05)。見表5。

3 討論

DNA甲基化作為一種表觀遺傳學調控方式，在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用［10］，并且已證實在某些情況下DNA甲基化是抑癌基因失活的唯一機制［11-12］。

本實驗發現，FHIT和CHFR基因甲基化存在于癌旁正常組織，可認為是大腸癌發生前已存在。FHIT和CHFR基因在大腸癌中的甲基化率顯著高于癌旁正常組織，亦表明FHIT和CHFR基因高甲基化與大腸癌的發生相關。本實驗還發現大腸癌FHIT和CHFR基因高甲基化與淋巴結轉移、組織分化程度顯著相關，而與性別、年齡、腫瘤部位、臨床分期等臨床因素無明顯相關，由于FHIT和CHFR基因高甲基化多發生于分化低和有淋巴結轉移的病例，因此，FHIT和CHFR基因高甲基化有可能作為評估大腸癌臨床預后的一個重要指標。另外，啟動子區甲基化使基因失活是一個可逆的過程，這與其他抑癌基因失活途徑有所不同，應用去甲基化劑能使高甲基化狀態發生去甲基化，激活抑癌基因，從而可以達到治療腫瘤的目的。由于FHIT和CHFR基因甲基化具有相關性，它們有可能共同促進了大腸癌的發生，需進一步研究。

表5 結直腸癌中FHIT基因的甲基化與臨床病理因素的關系

綜上所述，FHIT和CHFR基因甲基化可能是大腸癌發生、發展中的一個重要機制，FHIT和CHFR基因是抑癌基因，當其啟動子區甲基化時，易導致正常細胞的生長分化調控失常以及DNA損傷不能及時被修復，這可能與大腸癌形成密切相關，并有可能作為判斷大腸癌預后的一個重要指標。

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