沙棘葉中總多酚和總黃酮的提取工藝

李 峰劉 浩鐘 媛劉玉梅

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)中心，新疆 烏魯木齊 830046）

沙棘葉中總多酚和總黃酮的提取工藝

李 峰1劉 浩2鐘 媛1劉玉梅1

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)現(xiàn)代教育技術(shù)中心，新疆 烏魯木齊 830046）

利用正交試驗(yàn)L9（34）和單因素相結(jié)合的方法，研究采用超聲波輔助提取技術(shù)提取沙棘葉中總多酚和總黃酮的工藝。結(jié)果表明，沙棘葉中的總多酚和總黃酮在20kHz的超聲波作用頻率下極易溶出，優(yōu)化后的工藝條件為以40%的乙醇為提取劑，在20kHz的超聲波作用頻率下室溫萃取15min。在該條件下，沙棘葉總黃酮的提取率為5.034%，沙棘葉總多酚的提取率為10.712%。該方法具有簡便、高效，省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

沙棘葉；總多酚；總黃酮；超聲波；提取

沙 棘 （Hippophae rhamnoides L.） 為胡頹子科（Elaeagnaceae）酸刺屬的灌木或小喬木。沙棘在中國種植廣泛，它的根、莖、葉、花、果中含有200多種營養(yǎng)物質(zhì)［1］，其中所含的總黃酮類是沙棘的主要藥用活性成份［2］。目前對沙棘果實(shí)多酚及黃酮類化合物的研究報(bào)道很多，研究的也較深入，獲得了很多非常有價(jià)值的成果，但關(guān)于沙棘葉總多酚和總黃酮類化合物的綜合提取工藝的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)采用超聲波技術(shù)輔助溶劑提取的方法考察了沙棘葉總多酚與總黃酮的綜合提取工藝，旨在為沙棘葉中總多酚和總黃酮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘葉：采自新疆青河縣境內(nèi)；

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉等：均為市售分析純；

福林－酚：美國Sigma－Adrich公司；

蘆丁、沒食子酸：中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：BS210S，德國賽多利斯公司；

紫外/可見分光光度計(jì)：UV－5300PC，上海元析儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－S4，金壇市醫(yī)療儀器廠；

超聲波清洗儀：SY－3600，張家港市三友超聲設(shè)備廠；

三頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ－100UED型，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙棘葉總多酚及總黃酮提取工藝流程

沙棘葉粉末20目→乙醇提取→過濾→濾渣用乙醇溶劑洗滌2次→合并濾液→定容→測定總多酚和總黃酮含量

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

（1）超聲波頻率對提取率的影響：稱取2g沙棘葉，加入40mL 40%乙醇提取，提取溫度40℃，總提取時(shí)間為45min，期間超聲波輔助作用15min，設(shè)置超聲波頻率分別為20，45，80，100kHz。用分光光度計(jì)分別測總多酚及總黃酮的含量。

（2）水浴時(shí)間對提取率的影響：稱取2g沙棘葉，加入40mL 40%乙醇提取，提取溫度40℃，超聲波頻率20kHz，輔助作用15min，水浴時(shí)間分別為60，45，30，15min。用分光光度計(jì)分別測總多酚及總黃酮的含量。

（3）溫度對提取率的影響：稱取2g沙棘葉，加入40mL 40%乙醇提取，超聲波頻率20kHz，提取時(shí)間15min（期間超聲輔助10min），水浴溫度分別為70，60，50，40，30℃，室溫。用分光光度計(jì)分別測總多酚及總黃酮的含量。

（4）超聲波作用時(shí)間的影響：稱取2g沙棘葉，加入40mL 40%乙醇提取，超聲波頻率為20kHz，總提取時(shí)間15min，在室溫下，分別設(shè)置超聲波作用時(shí)間為15，10，5min。用分光光度計(jì)分別測總多酚及總黃酮的含量。

（5）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水浴溫度、水浴時(shí)間、超聲時(shí)間及乙醇濃度4個因素為考察因子，以綜合指標(biāo)作為評價(jià)依據(jù)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝參數(shù)。

1.3.3 黃酮定性試驗(yàn)

（1）絡(luò)合反應(yīng)：取1mL提取液于試管中，加3滴1%硝酸鋁溶液，在紫外燈下觀察顏色；或取1mL提取液于試管中，加2滴1%氯化鐵溶液，觀察顏色［3］。

（2）顯色反應(yīng)：取2～3滴提取液于濾紙上風(fēng)干，以揮發(fā)氨熏濾紙，觀察顏色；或向1mL提取液中加5mL 1mol/L氫氧化鈉溶液，觀察顏色［4］。

（3）還原反應(yīng)：取1mL萃取液于試管中，加入少量的鎂粉，搖勻，加4～5滴濃鹽酸，在水浴上加熱3min，觀察顏色變化。由于花色素本身在酸性條件下呈紅色，因此如果樣品中含有花色素，對此反應(yīng)具有干擾，空白為不加鎂粉［5］。

1.3.4 總黃酮含量的測定

（1）總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參照文獻(xiàn)［6］。

（2）總黃酮含量的測定：準(zhǔn)確吸取1.0mL提取液，按照1.3.4（1）的方法，將加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品用相應(yīng)的提取液來替代，測定其吸光值，代入上述蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出樣品的總黃酮含量?？傸S酮含量按式（1）計(jì)算：

式中：

M—— 總黃酮含量，g/100g；

C—— 提取液黃酮濃度，mg/mL；

V—— 提取液體積，mL；

n—— 稀釋倍數(shù)；

m—— 用于提取的沙棘葉質(zhì)量，g；

d——常數(shù)，使得m×d＝100g。

1.3.5 總多酚含量的測定 采用福林－酚比色法（Folin－Ciocalteu）。

（1）總多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：參照文獻(xiàn)［6］。

（2）總多酚含量的測定：將加入的標(biāo)準(zhǔn)樣品用相應(yīng)的提取物來替代，所測得的吸光值，代入上述沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求出樣品的總多酚含量。總多酚含量按式（2）計(jì)算：

式中：

M—— 總多酚含量，g/100g；

C—— 提取液多酚濃度，μg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

V——提取液體積，mL；

m——用于提取的沙棘葉質(zhì)量，g；

d—— 常數(shù)，使得m×d＝100g。

1.3.6 綜合指數(shù)的計(jì)算 本試驗(yàn)同時(shí)考察了沙棘葉中總多酚和總黃酮收率兩個指標(biāo)，綜合指標(biāo)是以這兩個指標(biāo)的加權(quán)和來計(jì)算的，以綜合指標(biāo)加權(quán)值高的水平組合為好。因總黃酮的收率為更重要的因素，綜合指數(shù)按式（3）計(jì)算：

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均是采用Microsoft Excel或OriginPro 7.5專業(yè)軟件來處理的。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棘葉中總多酚和總黃酮的工作曲線

用比色法測得蘆丁與沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，蘆丁的回歸方程為C＝0.082 9×A，R2＝0.999 9。沒食子酸的回歸方程為C＝109.95×A－7.053 9，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 1。均符合試驗(yàn)操作條件和工作要求。

2.2 提取沙棘葉總多酚及總黃酮的正交試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，沙棘葉中的總多酚和總黃酮在20kHz的超聲波作用頻率下極易溶出。因此，固定超聲波頻率為20kHz，以水浴溫度、水浴時(shí)間、超聲時(shí)間及乙醇濃度4個因素為考察因子，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)的因素水平取值見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonalexperiments

由表2可知，超聲時(shí)間影響最大，超聲時(shí)間為15min時(shí)提取效果最優(yōu)，3種乙醇濃度的提取結(jié)果相差不大，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，最終選擇40%乙醇為溶劑。結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)可知，反應(yīng)溫度越高以及水浴時(shí)間越長，綜合指數(shù)越低，可能是沙棘葉中總多酚和總黃酮對溫度比較敏感，容易損失；當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí)，易造成沙棘葉中活性成分的氧化損失。因此，確定反應(yīng)溫度為室溫，提取時(shí)間為15min。即：優(yōu)化后的工藝條件為以40%的乙醇為提取劑，在20kHz的超聲波作用頻率下室溫萃取15min。該條件下沙棘葉總黃酮的提取率為5.034%，總多酚的提取率為10.712%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of the orthogonal experiments

2.3 沙棘葉提取物的定性分析結(jié)果

由表3可知，沙棘果渣中的黃酮類化合物主要是以黃酮醇的形式存在［7］，而由表3可知，沙棘葉提取物中也含有這種物質(zhì)，另外可能還含有少量的黃酮類及二氫黃酮類化合物。

2.4 沙棘中總黃酮的提取比較

通過與已有文獻(xiàn)報(bào)道中總黃酮的提取率相比較（見表4），可知超聲波法具有省時(shí)，高效，能耗低，方法簡便，活性成分保留完全等優(yōu)點(diǎn)。

表3 顏色反應(yīng)結(jié)果Table 3 Results of color reaction

表4 總黃酮提取方法的比較Table 4 The comparison of the total flavonoid extraction methods

3 結(jié)論

沙棘葉中總多酚與總黃酮類化合物的含量豐富，利用超聲波輔助萃取可以明顯地提高萃取效率，由于沙棘葉多酚和黃酮類對溫度較為敏感，所以優(yōu)化的提取條件為以40%的乙醇為提取劑，在20kHz的超聲作用頻率下室溫萃取15min。該條件下，沙棘葉總黃酮的提取率為5.034%，沙棘葉總多酚的提取率為10.712%。

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3 李穎暢，孫建華，孟憲軍.藍(lán)莓葉總黃酮提取物的定性分析和抗油脂氧化［J］.食品科學(xué)，2010，31（13）：96～99.

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Technology of total polyphenols and total flavones extracted from sea buckthorn leaves

LI Feng1LIU Hao2ZHONG Yuan1LIU Yu－mei1

（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urmuqi，Xinjiang830046，China；2.Modern Education Technology Centerm，Xinjiang University，Urmuqi，Xinjiang830046，China）

The Ultrasonic－aided extraction technology of total polyphenols and total flavones extraction from Sea Buckthorn Leaves were investigated by orthogonal experiments L9（34）combined with single factor experiments.The results indicated that total polyphenols and total flavones were easily dissolution in 20kHz for ultrasonic frequency.The optimum conditions were as follows：ultrasonic frequency 20kHz effect，extraction time 15min，the ethanol concentration 40%and extraction temperature was room temperature.The flavone yields obtained under such conditions was 5.034%，the polyphenol yield was 10.712%.This technological method was simple and convenient，efficient，time－saving，which could provide practical significance for industrialization production.

sea buckthorn leaves；total polyphenol；total flavones；ultrasonic extraction；extract

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.035

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目（編號：200915125）

李峰（1987－），女，新疆大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：lifeng310＠yeah.net

劉玉梅

2012－01－27