HPLC－MS/MS測定豬肉和豬肝中氯霉素殘留量的研究

劉吉成

（廣西玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000）

HPLC－MS/MS測定豬肉和豬肝中氯霉素殘留量的研究

劉吉成

（廣西玉林食品藥品檢驗所，廣西 玉林 537000）

建立高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）檢測豬肉和豬肝中氯霉素藥物殘留的分析方法。樣品經(jīng)4%的氯化鈉溶液和乙腈提取并沉淀蛋白質(zhì)，正己烷脫脂凈化，乙酸乙酯液液萃取，再濃縮定容，上HPLC－MS/MS儀器，用Syncronis C18柱分離，以乙腈－水（40∶60）作為流動相，采用電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式檢測，用氯霉素－D5作內(nèi)標(biāo)物來定量。在該試驗條件下，氯霉素在1～15ng/mL濃度呈良好的線性關(guān)系，r＝0.999 2，最低檢出濃度為0.1μg/kg，樣品的加樣回收率在90.0%～110.0%，重復(fù)性好RSD＜3.0%。該方法能對豬肉和豬肝中氯霉素殘留進(jìn)行定性及定量分析，方法精密度較好、準(zhǔn)確度較高、選擇性好，結(jié)果滿意。

高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；氯霉素；豬肉；豬肝；殘留

氯霉素是一種酰胺醇類抗生素，可用于各種革蘭氏陰性細(xì)菌疾病的治療，曾被大量應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，但濫用會導(dǎo)致再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏等不良反應(yīng)［1］。許多國家都禁止在食用性動物飼養(yǎng)和治療中使用氯霉素，即最大殘留限量（MRL）為0mg/kg，中國農(nóng)業(yè)部193號公告中將氯霉素作為一種禁用物質(zhì)［2］。

目前國內(nèi)外常用免疫法和化學(xué)分析檢測法測定氯霉素殘留。粗篩方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、微生物法和生物傳感器法，確證方法有：液相色譜、氣相色譜、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用等方法［1］。液質(zhì)聯(lián)用方法是首選的最佳檢測手段，具有檢出限低、重現(xiàn)性好以及假陽性少等優(yōu)點。

有報道［3－5］用 HPLC、GC－MS和 HPLC－MS/MS測定豬肉中氯霉素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPLC測定氯霉素靈敏度相對低；用GC－MS測定氯霉素殘留，氯霉素必須衍生化后才能測定，操作復(fù)雜。本試驗采用HPLC－MS/MS測定豬肉和豬肝中氯霉素殘留，直接用對照品加到空白基質(zhì)中做標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用液液萃取進(jìn)行提取和純化，內(nèi)標(biāo)法定量，實現(xiàn)了消除基質(zhì)效應(yīng)，定量準(zhǔn)確的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

高效液相－質(zhì)譜聯(lián)用儀（配 MassLy4.1數(shù)據(jù)處理軟件）：Waters2695－Quattro MicroTMAPI，美國 Waters公司；

氮氣發(fā)生器：LC/MS20－1，英國Domnick hunter公司；

高速冷凍離心機(jī)：K280R，英國Centurion（森特恩）公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：Hei－VAPA 德國Heidolph公司；

氮吹儀：N－EVAPTM－112，美國 Organomation Associates公司；

電子分析天平：XS－205DU，美國 Mettler Toledo公司。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和試劑

乙腈、正己烷：色譜純，美國Fisher Scientific公司；

試驗用水：超純水，自制；

氯化鈉、乙酸乙酯等：分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司；

氯霉素對照品：含量99.5%，批號130555－200501，中國生物制品檢定所；

氯霉 素－D5：100ng/μL，德 國 Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 對照品和內(nèi)標(biāo)溶液的配制

1.2.1 對照品溶液的配制 取氯霉素對照品10.73mg，置100mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，再精密量取1mL置100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻作為對照品儲備液。

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密量取氯霉素－D5（100ng/μL）1mL置100mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度即得內(nèi)標(biāo)工作液（濃度為1μg/mL）。

1.3 樣品處理

1.3.1 樣品制備 豬肉去皮后絞碎，豬肝直接絞碎，分別裝入包裝袋，－20℃保存。

1.3.2 樣品提取 取測試樣品約5g，置50mL離心管中，加1μg/mL氯霉素－D5內(nèi)標(biāo)工作液10μL，加乙腈5mL，4%氯化鈉 溶 液［6，7］5mL，渦旋振蕩 2min，6000r/min 離 心10min，取上清液至另一50mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液。提取液中加乙腈飽和的正己烷5mL，渦旋振蕩1min，6 000r/min離心5min，棄去上層液（油脂多時可以多凈化幾次），加水飽和乙酸乙酯溶液5mL，渦旋振蕩1min，6 000r/min離心5min，將上層液轉(zhuǎn)移到100mL平底燒瓶中，重復(fù)提取3次，合并提取液，在40℃水浴減壓濃縮至約0.5mL，用氮氣吹至近干，殘渣加乙腈－水（40∶60）1.00 mL超聲溶解，搖勻，用微孔濾膜（0.22μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.4 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：SyncronisC18，粒徑5μm，150×2.1mm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量20μL；流動相：乙腈－水（40∶60）；流速：0.25mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式，采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓為2.8kV；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣氮氣流速為750L/h；錐孔氮氣流速為100L/h［8，9］；碰撞氣為氬氣；定性離子對、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量見表1。

表1 氯霉素和氯霉素－D5的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters of chloramphenicol and chloramphenicol－D5in MS

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

取5份空白基質(zhì)，將對照品儲備液加到空白基質(zhì)中，再在每個濃度中加入氯霉素－D5儲備液（1μg/mL）10μL，按1.3.2進(jìn)行處理得到濃度分別為 1.0，5.0，8.0，10.0，15.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，氯霉素－D5濃度為10ng/mL。按1.4的條件測定，按照內(nèi)標(biāo)法計算得到曲線方程：

式中：

Y——響應(yīng)值（對照品峰面積×內(nèi)標(biāo)物濃度/內(nèi)標(biāo)物峰面積），ng/mL；

X——對照品濃度，ng/mL。

內(nèi)標(biāo)物的RSD為3.3%。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1，對照品中各個離子和總離子流圖色譜圖分別見圖2和圖3。

圖1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 1 The standard curve of chloramphenicol

2.2 準(zhǔn)確度和精密度試驗

分別取空白的樣品基質(zhì)豬肉和豬肝約5g，添加不同濃度的氯霉素，用內(nèi)標(biāo)法做加樣回收試驗，測定的數(shù)據(jù)見表2和表3。

由表2和表3可知，樣品回收率都在90%～110%，相對偏差都少于3.0%，說明該方法對豬肉和豬肝等樣品含有氯霉素測定均有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.3 檢出限

根據(jù)限量要求，對豬肉和豬肝加標(biāo)回收試驗，當(dāng)添加濃度為0.1μg/kg時，定量離子信噪比S/N＝3.1，試驗結(jié)果表明氯霉素的檢出限為0.1μg/kg。

圖2 對照品溶液MRM色譜圖Figure 2 MRM chromatogram of standard solution

圖3 陽性豬肉樣品MRM色譜圖Figure 3 MRM chromatogram of positive Pork sample

2.4 樣品的測定

在市場上畜禽類共抽樣160批，其中豬肉128批，豬肝32批，其中豬肉檢出有氯霉素的有8批，豬肝0批，其濃度均在2～50μg/kg。

表2 豬肉樣品加樣回收的數(shù)據(jù)Table 2 Sample recovery results of pork

表3 豬肝樣品加樣回收的數(shù)據(jù)Table 3 Sample recovery results of pig liver

3 討論

（1）在選擇流動相時，曾嘗試用乙酸胺加0.1%甲酸做水相，發(fā)現(xiàn)對照品均不出峰，而以純水作水相時有峰出現(xiàn)。這可能是離子的存在干擾了化合物的電離。在選擇有機(jī)相的時候，采用甲醇和乙腈均可行，但使用乙腈其靈敏度稍高，所以以乙腈和水作為流動相。

（2）在樣品提取的過程中，僅用乙腈提取的時提取物的油脂含量較高，凈化較為困難，但加入4%NaCl溶液以后，可有效降低提取物的油脂含量。

（3）在配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的過程中，加基質(zhì)的對照品的峰面積和不加基質(zhì)的相差比較大，說明基質(zhì)效應(yīng)強，所以選擇對照品加到空白基質(zhì)中來配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的偏差。

4 結(jié)論

本試驗建立的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測畜禽類中豬肉和豬肝氯霉素殘留，采用乙腈和4%NaCl溶液提取樣品中氯霉素成分，并同時沉淀樣品中的蛋白質(zhì)，用正己烷除掉油脂性成分，再用乙酸乙酯萃取，濃縮，內(nèi)標(biāo)法定量，并用空白基質(zhì)加對照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。本方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好。與其他檢測方法相比，在前處理上易于操作，減少了基質(zhì)效應(yīng)，檢驗成本低，適用范圍廣，靈敏度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠，選擇性好，可用于畜禽類氯霉素殘留的檢驗方法。

1 任佳，鄭小平，黃菲菲，等.UPLC－MS/MS法測定乳制品中氯霉素類藥物［J］.食品與機(jī)械，2011，27（4）：75～78.

2 劉正才，楊方，余孔捷，等.獸藥粉中氯霉素類和硝基呋喃類藥物的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法的研究［J］.中國獸藥雜志，2011，45（9）：40～43.

3 李海平，張樹海，張坤生.GC－MS分析法在豬肉氯霉素殘留檢測中的應(yīng)用［J］.食品與機(jī)械，2006，22（5）：89～92.

4 農(nóng)以寧，蔡江帆，蒙肇云，等.SPE－HPLC法同時測定豬肉中常見的抗生素和克侖特羅的研究［J］.桂林電子科技大學(xué)學(xué)報，2009，29（5）：406～409.

5 楊總，李秀琴，王娟，等.同位素稀釋液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定豬肉中的氯霉素殘留［J］.色譜，2011，29（9）：927～931.

6 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T22338——2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的殘留測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

7 李麗莉，羅軼.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定雞肉中氯霉素殘留［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，21（6）：1 357～1 358.

8 張立堅，張俊杰，張良滔，等.液相色譜－質(zhì)譜法檢測漁業(yè)養(yǎng)殖水中硝基呋喃及氯霉素藥物［J］.質(zhì)譜學(xué)報，2011，32（4）：207～210.

9 陳君義，孫慧宇，舒永蘭，等.同位素內(nèi)標(biāo)液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中氯霉素殘留［J］.化學(xué)分析計量，2011，20（2）：46～48.

Determination of chloramphenicol residues in pork and pig liver by LC－MS/MS

LIU Ji－cheng

（YuLin Institute for Food and Drug Control，Yulin，Guangxi537000，China）

A method of determination of chloramphenicol in pork and pork liver by High Liquid chromatography－Tandem Mass Spectrometry（HPLC－MS/MS）was developed.Samples were extracted with acetonitrile and 4%sodium chloride solution，and precipitation protein at the same time，defatted by hexane，and Ethyl acetate liquidliquid extraction，then concentrated and constanted volume.Samples were detected by LC－MS/MS and isolated with Syncronis C18and the liquid phase was acetonitrile and water（40∶60），The electrospray ionization（ESI）mass spectrometry was run in negative ion multiple reaction monitoring mode，taking the chloramphenicol－D5as internal standard.At these experimental conditions，chloramphenicol had a good liner relatively（r＝0.999 2）between 1～15ng/mL.recovery rate of samples ranged from 90.0%～110.0%，with LOD of 0.1μg/kg，and replicability was RSD＜3.0%.This method could detect the chloramphenicol residue in pork and pork liver，and with a better precision，higher accuracy，better specificity，and the result was satisfied.

HPLC－MS/MS；chloramphenicol；pork；pig liver；residues

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.025

劉吉成（1982－），男，廣西玉林食品藥品檢驗所主管藥師，碩士。E－mail：liujichenggood＠126.com

2012－01－22