蘆丁的酶法轉化及其產物異槲皮苷的分離

吳 迪,劉廷強,王東明,金鳳燮,魚紅閃

(大連工業大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034)

蘆丁的酶法轉化及其產物異槲皮苷的分離

吳 迪,劉廷強,王東明,金鳳燮,魚紅閃

(大連工業大學 生物工程學院,遼寧 大連 116034)

利用微生物Absidia sp.R9g產的蘆丁-α-鼠李糖苷酶(RhaR)轉化蘆丁制備異槲皮苷,采用硅膠柱層析法對酶解產物進行分離純化。結果表明,24.0 g蘆丁的酶解產物,經分離可得到較純的異槲皮苷單體13.1 g,其得率為49.4%。通過高效液相色譜檢測其純度達到98.3%。

蘆丁-α-鼠李糖苷酶；酶轉化；異槲皮苷

0 引 言

異槲皮苷屬于黃酮類物質,是蘆丁的衍生物,僅比蘆丁少一個鼠李糖,但其藥理活性卻明顯高于蘆丁。異槲皮苷具有抗炎、抗氧化、抗誘變等多種藥理作用[1-2],并可有效地用于防治高血壓、糖尿病、冠心病及神經衰弱等疾病[3]。異槲皮苷雖然在植物中分布較廣[4],但是在這些植物中的含量卻極低,如果從植物中直接提取,工作量較大、且得率較低,從而極大地限制了人們對其進一步的研究和應用。因此如何大量制備異槲皮苷成為了該研究領域的重要課題。

傳統的工業化生產一般采用強酸對蘆丁進行水解[5],該法不利于環境保護,且很難控制中間產物異槲皮苷的生成。另有研究從植物生物質中提取和純化黃酮類物質,但此法需要昂貴的生物酶制劑,且工藝設備較復雜,生產成本高。

本實驗室已經篩選出一種微生物菌株[6],該微生物能產生一種鼠李糖苷酶。此酶能夠專一高效地水解蘆丁分子上的鼠李糖基,生成產物異槲皮苷。此方法操作簡單安全,并且整個過程反應便于控制,能大量生成中間產物異槲皮苷,產出量大,且產物純度高。因此,利用酶法轉化自然界中廣泛存在且含量較高的蘆丁,大量制備天然含量低、附加值高的異槲皮苷單體,具有重要意義,可以廣泛應用于食品和工業。

1 材料與方法

1.1 材 料

蘆丁、槲皮素、異槲皮苷樣品,美國Sigma公司；菌種Absidia sp.R9g,大連工業大學生物工程學院菌種保藏所；薄層層析板(TLC),德國Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶液的制備

液體培養基配方：在12%的槐花浸出液中加入48%的麥芽汁,其余的40%用水補齊,最終制成麥芽汁濃度為5°的RhaR液體發酵培養基,121℃下濕熱滅菌。

將Absidia sp.R9g接種于液體發酵培養基中,接種量為1～2環。然后將其置于全溫振蕩器中,在30℃、160 r/min的條件下培養菌體4～5 d。取發酵好的6 000 m L發酵液,用高速冷凍離心機在7 000 r/min下離心10 min,進而去除菌體,收集上清液；使用磁力攪拌儀,緩慢加入硫酸銨粉末至80%飽和度,在4℃下靜置3～4 h；再離心,棄上清,收集蛋白質沉淀；沉淀用600 m L的0.02 mol/L pH 5.0的 HAc-Na Ac緩沖液溶解,在7 000 r/min下離心10 min,所得上清液即為粗酶液。

1.2.2 酶活力的測定

配制 10 mg/m L(0.02 mol/L pH 5.0 的HAc-Na Ac緩沖液0.8 m L加95%乙醇0.2 m L)的蘆丁底物溶液,取0.1 m L底物溶液與0.1 m L粗酶液混合,50℃進行酶解反應8 h,然后加入0.2 m L的水飽和正丁醇終止酶反應；振蕩、分層,取上層液作薄層層析檢測,點樣量為10μL,通過展開劑展開后在紫外下顯色檢測,應用Bandscan工具軟件進行產物含量分析。

酶活力單位定義：在上述條件下,每小時生成1μg異槲皮苷的酶量為一個酶活力單位。

1.2.3 蘆丁的酶轉化反應

本實驗組前期對該粗酶液進行了酶反應條件的優化,確定最佳底物質量分數為4%、最佳反應時間為8 h、最佳反應溫度為50℃、最佳pH為5.0。在此基礎上進行酶轉化反應,準確稱量24.0 g蘆丁,加入480 m L 0.02 mol/L pH 5.0的HAc-Na Ac緩沖溶液和120 m L 95%的乙醇。然后加入600 m L酶液,混合后置于恒溫50℃的反應釜中,攪拌反應8 h后終止酶反應。將反應液在7 000 r/min下高速冷凍離心10 min,然后對上清液進行濃縮、干燥,得到粗產品。反應后將酶液回收,重復進行5次酶反應以大量制備異槲皮苷。

1.2.4 產物異槲皮苷的分離純化

利用硅膠柱層析對酶反應產物進行分離純化。首先制備樣品膠,將蘆丁酶轉化的酶解產物混合樣品用于上樣,用200 m L甲醇完全溶解。加入3倍樣品質量的80～100目的硅膠,攪拌至顆粒均勻,在通風櫥中的水浴鍋上加熱揮發至完全干燥。將厚度均勻的脫脂棉置于玻璃柱(φ8.2 cm×20 cm)底端,先裝入15倍樣品質量的300～400目的分離膠,抽真空使柱面平整,然后裝入已經干燥好的樣品膠,并于柱頂覆一層脫脂棉,保持柱面平整。最后對其進行洗脫,首先用純氯仿打通硅膠柱,再用氯仿-甲醇洗脫劑(體積比為9.2∶0.8)對其進行洗脫,每次洗脫250 m L,由TLC檢測監控洗脫過程,最后用純甲醇將柱上殘留的組分洗脫下來。洗脫完畢根據TLC檢測結果,分類合并相同組分,將其濃縮干燥,稱重。

1.2.5 高效液相色譜(HPLC)檢測

采用高效液相色譜(HPLC)法對產品異槲皮苷進行純度檢測。色譜儀為Waters 2695高效液相色譜分析儀,利用 Waters 2996二極管陣列檢測器及Empower色譜工作站對蘆丁水解產物進行純度檢測。其中色譜條件為：中匯達的Kromasil C18反相色譜柱(φ4.6 mm×250 mm)；檢測波長265 nm；體積流量1.0 m L/min；進樣量10μL；柱溫35℃。流動相為55%甲醇、45%水和0.4%的H3PO4混合液。

1.2.6 薄層層析(TLC)檢測

將標準品和樣品溶于甲醇中,用微量點樣器吸取少量溶液,少量多次點在硅膠薄層層析板的起始線上,每次點樣經電吹風風干后,將其置于盛有展開劑的層析缸中展開。當展開劑到達層析板上緣時,取出吹干表面溶劑,置于紫外分析儀中觀察結果。參照標準品斑點位置確定樣品中所含成分。所用展開劑的體積比為V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)＝10∶7∶1∶1。

2 結果與討論

2.1 蘆丁的酶轉化反應

菌種Absidia sp.R9g經5 d恒溫培養,80%的硫酸銨粉末沉淀,沉淀經0.02 mol/L pH 5.0的HAC-Na AC緩沖液溶解得到600 m L粗酶液。取0.1 m L粗酶液與0.1 m L底物溶液相混合,50℃進行酶解反應8 h,然后加入0.2 m L的水飽和正丁醇終止酶反應,振蕩、分層,取上層液作TLC檢測,并測定其酶活力為696.6 U/m L。TLC結果如圖1所示,底物蘆丁轉化較徹底,轉化率達到了95%以上。

利用此酶進行底物蘆丁的酶轉化反應。準確稱量24.0 g蘆丁,加入480 m L 0.02 mol/L pH 5.0的 HAc-Na Ac緩沖溶液和120 m L 95%的乙醇,然后加入600 m L酶液,混入恒溫50℃的反應釜中,攪拌反應8 h后終止酶反應。將反應液在7 000 r/min下高速冷凍離心10 min,然后對上清液進行濃縮、干燥,得到粗產品質量為26.5 g。產物量比投料量大的主要原因是,在酶反應的過程中有少量的糖類、蛋白質以及色素等雜質生成。回收粗酶液再與24.0 g蘆丁進行酶反應,重復進行5次,120.0 g的蘆丁經酶轉化得到粗產品128.5 g。

圖1 蘆丁-α-鼠李糖苷酶粗酶水解蘆丁的TLC圖譜Fig.1 TLC of rutin-α-rhamnosidase hydrolysis

2.2 產物的異槲皮苷分離純化

取24.0 g蘆丁酶轉化產物的粗品,采用硅膠柱柱層層析法對其進行分離純化,洗脫梯度為V(氯仿)∶V(甲醇)＝9.2∶0.8,每次收集250 m L,共洗脫35瓶,用薄層層析板點樣跟蹤,根據TLC結果,將相同組分合并收集并濃縮干燥。其中單點異槲皮苷部分質量為13.1 g,異槲皮苷的得率為49.4%,其TLC圖見圖2,其中第12～26瓶在板上顯示為單點。

圖2 硅膠分離產物的TLC圖譜Fig.2 TLC result of separation by silica gel

2.3 高效液相色譜測定純度

經硅膠柱分離得到的異槲皮苷單體,利用高效液相色譜對其進行純度鑒定。取1.0 mg的樣品,用甲醇定容于10 mL的容量瓶中,進樣量為10μL,測定結果顯示純度為98.3%,HPLC結果見圖3。

圖3 異槲皮苷HPLC色譜圖Fig.3 HPLC of isoquercitrin

3 結 論

由實驗結果可以得出,利用Absidiasp.R9g菌產的蘆丁-α-鼠李糖苷酶粗酶液,轉化蘆丁生成異槲皮苷的效果較為理想,反應時間短,轉化率達到了95%以上,該酶液可反復回收利用多次,且酶活損失少。該法較傳統的化學法有更多優勢,不僅反應條件溫和,對底物的選擇性強,而且反應過程容易控制。總之,可以通過酶法簡單方便地制備產物異槲皮苷,為實現工業化生產提供了理論依據。

[1]SOSA S,PACE R,BORNANCINA,et al.Topical anti-inflammatory activity of extracts and compounds fromHypericumperforatum L[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology,2007,59(5)：703-709.

[2]SNIJMAN P,SWANEVELDER S,JOUBERT E,et al.The antimutagenic activity of the major flavonoids of Rooibos(Aspalathus Linearis)：some doseresponse effects on mutagen activation-flavonoid interactions[J].Mutation Research,2007,631(2)：111-123.

[3]王天仕,鄭舍勛,魏高明.槐花對家兔體外心房肌的作用[J].山東中醫藥雜志,2002,21(5)：297-299.

[4]嚴安定,袁野,吳亮,等.HPLC法同時測定桑葉中蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽醫藥,2011,15(3)：296-297.

[5]孫兵,貢盈歌,舒曉宏,等.槲皮素制備方法的改進[J].大連醫科大學學報,2008,30(1)：93-95.

[6]王侃,魚紅閃,金鳳燮.蘆丁-α-鼠李糖苷酶分離提純及其酶性質[J].大連輕工業學院學報,2004,23(1)：30-33.

(WANG Kan,YU Hong-shan,JIN Feng-xie.Purification and characterization of rutin-α-rhanmosidase[J].Journal of Dalian Institute of Light Industry,2004,23(1)：30-33.)

The enzymatic transformation of rutin and the separation of the hydrolysate isoquercitrin

WU Di,LIU Ting-qiang,WANG Dong-ming,JIN Feng-xie,YU Hong-shan
(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Isoquercitrin was transformation from rutin by rutin-α-rhamnosidase(RhaR)produced with Absidia sp.R9g.Hydrolysate was separated from 24.0 g rutin by silica gel column and 13.1 g isoquercitrin was obtained.The yield was 49.4%and the purity of the product was 98.3%.

rutin-α-rhamnosidase；enzymatic transformation；isoquercitrin

Q556.2；Q946.83

A

1674-1404(2012)06-0399-03

2011-11-11.

遼寧省教育廳創新團隊項目(2009T007).

吳 迪(1987-),女,碩士研究生；通信作者：魚紅閃(1968-),男,教授.