對羥基聯(lián)苯比色法測定葡萄酒發(fā)酵過程中的乳酸

楊 江 威, 王 越, 安 家 彥

( 大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

乳酸是葡萄汁酒精發(fā)酵的主要副產物之一,其酸味較弱,可使葡萄酒口感變得柔和,在葡萄酒中乳酸的質量濃度一般低于1 g/L[1]。目前乳酸定量測定的方法主要有毛細管電泳法、EDTA定鈣法、酶法、HPLC分析法和酶電極生物傳感器法,其中毛細管電泳法操作簡單、用樣量少、時間短,受其他非離子組分干擾較少,定量較準確,但是分析過程中所用緩沖液較復雜；EDTA定鈣法對樣品的預處理較復雜；酶法和HPLC分析法對實驗操作條件及費用要求均較高；酶電極生物傳感器法具有快速、專一、簡便的特點,不需要分離可直接測定,但是所用儀器成本太高。此外有文獻報道采用對羥基聯(lián)苯比色法測定白酒[2]、啤酒[3]和尿液[4]中的微量乳酸濃度。此方法所用儀器操作簡便、特異性好、靈敏度高、實用性強,但對葡萄酒中乳酸的定量檢測還未見報道。

本研究采用對羥基聯(lián)苯比色法對葡萄汁發(fā)酵過程中的乳酸進行定量測定,研究了測定方法的精密度、回收率和測定過程中其他有機酸的影響,探討了葡萄酒酒精發(fā)酵過程中乳酸的變化情況。

1 材料與方法

1.1 菌 種

葡萄酒酵母,為本實驗室保藏菌種,保存在YEPD斜面培養(yǎng)基上,每2個月轉接1次。

1.2 主要試劑

乳酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸、偏重亞硫酸鉀、乳酸鋰、硫酸銅、氫氧化鈣、氫氧化鈉、對羥基聯(lián)苯、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈣,均為分析純試劑；玉米漿,濃硫酸。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母膏10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂20,加蒸餾水定容至1 000 mL,pH 6.0、115 ℃濕熱滅菌20 min。

1.4 乳酸的測定

采用對羥基聯(lián)苯比色法[3-4]測定乳酸。

1.5 酵母干重的測定

采用光電比濁法[5]測定酵母干重。

1.6 還原糖的測定

采用DNS法[6]測定發(fā)酵液中還原糖。

1.7 種子培養(yǎng)液的制備

取斜面培養(yǎng)基上葡萄酒酵母2環(huán)接入裝有50 mL糖度為2%的葡萄汁的250 mL三角瓶中,28 ℃培養(yǎng)36 h,每12 h振蕩1次[7]。

1.8 不同品種葡萄汁的酒精發(fā)酵

濃縮巨峰葡萄汁和濃縮白葡萄汁的糖濃度均為60%,按還原糖可生成酒精量為12%(Vol)進行稀釋,均加入60 mg/L的SO2防止葡萄汁氧化,同時起到抑菌作用。用1 000 mL三角瓶發(fā)酵,裝液量為600 mL,將種子培養(yǎng)液按5%(體積分數)的量[8]接種到葡萄汁中,裝發(fā)酵栓,將巨峰葡萄汁和白葡萄汁分別在25和20 ℃發(fā)酵15 d,定時取樣,測定發(fā)酵液中乳酸的濃度。

1.9 發(fā)酵液樣品中乳酸的測定

將葡萄汁發(fā)酵液稀釋70倍,按照方法“1.4”測定發(fā)酵液中的乳酸,并按下式計算。

ρ=(OD565-b)N/k

式中,ρ為乳酸質量濃度，mg/L；OD565為在波長565 nm下測得的吸光值；b為標準曲線的截距；N為稀釋倍數；k為標準曲線的斜率。

2 結果與分析

2.1 乳酸標準曲線的測定

分別準確配制5、10、15、20、25、30 μg/mL乳酸標準溶液,按照方法“1.4”進行測定,以乳酸濃度為橫坐標,以OD值為縱坐標,得到回歸方程為y=0.010 9x+0.115,R2=0.991 6。

2.2 乳酸測定方法的精密度

將葡萄汁發(fā)酵液稀釋70倍,取6個平行樣,在565 nm下測其吸光值,結果如表1所示。

表1 乳酸測定方法的精密度

6個樣品的OD值相對標準偏差為1.213%,表明對羥基聯(lián)苯比色法測定乳酸的精密度較高。

2.3 其他有機酸對乳酸測定的影響

在4份25 mL 0.5 g/L的乳酸溶液中,分別加入蘋果酸102.5 mg、檸檬酸7.78 mg、酒石酸119.55 mg[9]、琥珀酸12.5 mg,混勻,稀釋70倍,在565 nm下測其吸光值,結果如表2所示。

表2 其他有機酸對乳酸測定的影響

Tab.2 Effects of other organic acids on determining lactic acid

樣品OD565乳酸乳酸+檸檬酸乳酸+蘋果酸乳酸+酒石酸乳酸+琥珀酸0.1030.1140.1050.1000.121

由表2數據可知,蘋果酸、檸檬酸和酒石酸對乳酸的測定影響很小。但是琥珀酸對乳酸的測定的影響較大,琥珀酸不存在于葡萄漿果中,它主要來源于酒精發(fā)酵[10],在葡萄酒中的濃度很小,所以對乳酸測定的影響可忽略不計。

2.4 乳酸測定方法的回收率

在葡萄汁發(fā)酵液中加入不同量的乳酸標準溶液,稀釋70倍,測定結果如表3所示。

表3 乳酸測定方法的回收率

由表3可知,回收率范圍為98.10%～103.05%,平均回收率為100.46%,本法定量測定發(fā)酵液中的乳酸準確度較高。

2.5 酒精發(fā)酵過程中乳酸的消長

考查不同品種葡萄汁酒精發(fā)酵過程中乳酸的消長,其中白葡萄汁初始糖質量濃度為192.827 g/L,巨峰葡萄汁初始糖質量濃度為166.423 g/L,分別在20和25 ℃進行酒精發(fā)酵,定時取樣,分別按照方法“1.4”、“1.5”和“1.6”測定乳酸的質量濃度、酵母干重和還原糖質量濃度,結果分別如圖1和2所示。

圖1 白葡萄汁中的酒精發(fā)酵過程

Fig.1 Alcoholic fermentation process of white grape juice

圖2 巨峰葡萄汁中的酒精發(fā)酵過程

Fig.2 Alcoholic fermentation process of Kyoho grape juice

由圖1、2可知,白葡萄汁在剛接入種子培養(yǎng)液時,乳酸的質量濃度為0.310 g/L,而巨峰葡萄汁中沒有檢出乳酸。隨著發(fā)酵過程的進行,酵母干重逐漸增加,還原糖逐漸消耗,兩種葡萄汁發(fā)酵液中乳酸生成量均逐漸增加。由圖1可知,當白葡萄汁發(fā)酵第8天時,乳酸的質量濃度達到最大值；第11～18天,乳酸的生成量趨于穩(wěn)定。由圖2可知,發(fā)酵3 d后酵母干重迅速增加,還原糖的消耗量也迅速增加,此時一部分的糖被用于酵母生長繁殖,另一部分用于生成酒精；發(fā)酵3 d 后乳酸質量濃度以每天0.1 g/L的速度增加,第10天達到最大值,其后稍有下降并漸趨于穩(wěn)定。有文獻報道葡萄酒中乳酸的質量濃度一般低于1 g/L,由不同品種葡萄汁酒精發(fā)酵的實驗數據可知,乳酸生成量的最大值分別為1.424 和1.188 g/L,均大于1 g/L,表明葡萄酒中的乳酸大部分是在酒精發(fā)酵過程中產生的。

3 結 論

采用對羥基聯(lián)苯比色法測定葡萄汁在酒精發(fā)酵過程中乳酸的生成量,結果表明,此方法的相對標準偏差為1.213%；回收率范圍為98.10%～103.05%,平均回收率為100.46%；其他有機酸對乳酸測定影響研究表明,酒石酸、檸檬酸、蘋果酸均無大影響,琥珀酸對乳酸測定的影響稍大,而琥珀酸在葡萄酒中的濃度是微量的,對乳酸測定的影響可忽略不計,所以采用此方法測定葡萄酒中乳酸的含量結果真實可信。

同時采用此比色法對不同品種的葡萄汁在酒精發(fā)酵過程中乳酸的生成量進行跟蹤測定,結果表明,隨著酵母干重的增加,還原糖的消耗,乳酸呈增長趨勢；當乳酸的生成量達到最大值后均稍有下降,隨后又趨于穩(wěn)定,并且兩種葡萄汁在酒精發(fā)酵過程中乳酸質量濃度的最大值均大于1 g/L,表明乳酸的生成大部分是在酒精發(fā)酵過程中進行的。

[1] 李華,王華,袁春龍,等. 葡萄酒工藝學[M]. 北京:科學出版社, 2007, 79-80.

[2] 李志斌,姚珍. 白酒中乳酸的測定方法[J]. 釀酒科技, 2003, 5(2):81-82.

[3] 高慶,印建和,穆華容,等. 對羥基聯(lián)苯法測定啤酒中乳酸[J]. 釀酒, 2005, 32(6):93-95.

[4] 朱新友,吳戾. 對羥基聯(lián)苯法測定尿中乳酸的探討[J]. 陜西醫(yī)學檢驗, 1999, 14(3):21-22.

[5] 杜以文. 幾種酒精發(fā)酵酵母的乳酸生成動力學[D]. 大連:大連工業(yè)大學, 2011.

[6] 仝瑛,倪士峰,劉建利,等. DNS法測定菊芋中還原糖含量的研究[J]. 陜西中醫(yī), 2009, 30(11):1535-1537.

[7] 蘇暢. 葡萄酒活性干酵母的研究[D]. 天津:天津科技大學, 2004.

[8] KIM D H, HONG Y A, PARK H D. Co-fermentation of grape must byIssatchenkiaorientalisandSaccharomycescerevisiaereduces the malic acid content in wine[J]. Biotechnol Letters, 2008, 30(9):1633-1638.

[9] 俞然,尹吉泰,邢凱,等.漢沽玫瑰香葡萄成熟期有機酸的分析[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2009(5):66-67.

[10] 李君霞,都振江,王煥香,等. 沙城產區(qū)赤霞珠、霞多麗葡萄發(fā)酵過程中主要有機酸的變化[J]. 中外葡萄與葡萄酒, 2007(4):54-55.