銀花泌炎靈片對大腸埃希菌的抑菌機制

胡 亞，王冀邯，張曉天，王槐棟，趙春燕，王 放

（吉林大學白求恩醫學院，吉林 長春 130021）

銀花泌炎靈片對大腸埃希菌的抑菌機制

胡 亞，王冀邯，張曉天，王槐棟，趙春燕，王 放*

（吉林大學白求恩醫學院，吉林 長春 130021）

目的 檢測銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌的體外抑菌活性；并通過繪制時間-殺菌曲線（KCs）探討其抑菌機理。方法 采用瓊脂稀釋法進行大腸埃希菌標準菌株ATCC 25922和20株泌尿系統感染者臨床分離株的體外抑菌活性研究，測定最小抑菌濃度（MIC）并繪制KCs。結果 銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌標準菌株和臨床分離株都具有抑菌活性，MIC50-90均為50～100mg/mL；從繪制出的KCs可以看出：與對照組相比，銀花泌炎靈片95%乙醇提取物可以使細菌對數生長期延遲出現，并縮短細菌平臺期。結論 銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌具有一定的抑菌活性，其初步抑菌機理可能與其延長細菌的分裂周期，抑制細菌的生長繁殖有關。

銀花泌炎靈片；大腸埃希菌；抑菌活性；最小抑菌濃度；抑菌機理

泌尿系統感染是臨床常見、多發的感染性疾病，病程頑固遷延，具有治療時間長、復發率高等特點。近年來隨著抗生素的廣泛應用，導致了臨床耐藥菌株的增加，使抗生素效率大大降低。因此，尋求治療泌尿系統感染的抗生素替代藥物迫在眉睫。我國中醫藥歷史悠久，研究發現，傳統中藥有清熱解毒、抗菌等作用[1-2]，具有相對安全、不良反應小、價格低廉、不易產生耐藥性等優點，在抗感染治療臨床應用中存在巨大的開發潛力[3]。

銀花泌炎靈片是由金銀花、半枝蓮、扁蓄、瞿麥、石韋、川木通、車前子、淡竹葉、桑寄生、燈心草等組成的純中藥制劑，具有清熱解毒，利濕通淋的功效。臨床常用于治療急性腎盂腎炎，急性膀胱炎，下焦濕熱證等泌尿系統感染，是目前臨床治療難治性泌尿系統感染的常用藥。然而，卻未見有關銀花泌炎靈片抑菌機制的研究。本研究通過KCs法探討“銀花泌炎靈片”對泌尿系統感染主要致病菌大腸埃希菌的初步抑菌機理，為其臨床應用和推廣提供更堅實的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

標準菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，保存于吉林大學病原生物學教研室；20株大腸埃希菌臨床分離株：吉林大學第一醫院泌尿系統感染患者標本中分離，經本實驗室鑒定保存。

1.2 藥品

試驗藥物：銀花泌炎靈片95%乙醇提取物, 由吉林大學藥學院新藥研究室提供；對照藥物：雙黃連膠囊（河北奧星集團藥業有限公司，國藥準字Z10980155，產品批號100520）。

1.3 主要試劑和儀器

M-H肉湯培養基（青島高科技園海博生物技術有限公司；產品批號20100517）；營養瓊脂培養基（北京雙旋微生物培養基制品廠，產品批號20111202）；生物安全柜（AIRTECH BHC-1300ⅡA/B）、紫外分光光度計（UNIC UV-2800AH）、電熱恒溫培養箱（DPX-9162B-1）。

1.4 藥物敏感性試驗

1.4.1 菌液制備 取出復蘇好的菌種，挑選1～2個典型的菌落接種于20 mL M-H肉湯培養基內，37℃恒溫振搖3～4 h，此時生長濁度約為9×108cfu / mL，用M-H肉湯培養基稀釋為0.5麥氏濁度標準濃度的菌液備用。

1.4.2 瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）[4]配制藥物-營養瓊脂平板培養基，使藥物的終濃度分別為200、100、50、25、12.5mg / mL。取100 uL 0.5麥氏濁度標準濃度的稀釋菌液涂布于平板表面，37℃培養18 h后，記錄MIC。

1.5 繪制時間-殺菌曲線（KCs）[5]

取無菌試管3支，每管加10 mL MH肉湯。第1管加入終濃度為100mg/mL銀花泌炎靈片95%乙醇提取物，第2管加入終濃度為100mg/mL雙黃連膠囊，第3管作為陰性對照。在各管中分別加入0.1 mL濃度為0.5麥氏濁度標準的待測菌液，使其終濃度為106cfu/mL 37℃恒溫培養箱內培養16 h，每2 h從各管取樣0.1 mL，加入到含有0.9 mL 0.9%的生理鹽水的試管中，編號為1，從中取出0.1 mL加入到另一含有0.9 mL生理鹽水的試管中，編號為2，以此類推，稀釋至第10管，其濃度依次為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10cfu / mL，分別從每只試管中取出0.1 mL菌液，均勻涂布于已滅菌的營養瓊脂平板上，每個濃度2個平板，于37 ℃恒溫培養箱內培養16～18 h，用肉眼進行菌落計數，只計數菌落數在30～300個的平板，取其平均數，根據稀釋濃度計算原菌液的濃度。

2 結果

2.1 體外抑菌活性

銀花泌炎靈片95%乙醇提取物的MIC50-90為50～100mg/mL，陽性對照藥物雙黃連膠囊的MIC50-9050～100mg/mL。“銀花泌炎靈片”95%乙醇提取物對大腸埃希菌具有一定的抑菌活性，和陽性對照藥物雙黃連膠囊抑菌效果相當。結果見表1。

表1 銀花泌炎靈片對大腸埃希菌體外抑菌結果

2.2 時間-殺菌曲線（KCs）結果

經Orange 7.5軟件畫圖，時間-殺菌曲線（KCs）結果見圖1。由圖可見：與對照組相比，各實驗組均從0 h開始對大腸埃希菌ATCC 25922生長發揮抑制作用，大腸埃希菌的生長明顯受到抑制，菌體的生長處于較低的水平；對數期較正常菌延遲4 h左右出現，平臺期縮短，直接進入衰退期。臨床株的時間-殺菌曲線（KCs）與ATCC 25922曲線圖形相似。

圖1 大腸埃希菌ATCC 25922時間-殺菌曲線（KCs）

3 討論

目前對于中藥抑菌機理方面的研究報道較少，有學者認為抑菌中藥的可能抑菌機理為破壞細菌的新陳代謝，改變細菌細胞的通透性，氧化細菌體內的活性基團，破壞菌體蛋白或酶蛋白等[6]。但由于抑菌中藥多是復方制劑，抑菌活性可能是中藥中的多種單體成分通過多個抑菌途徑共同起作用的結果。因此，抑菌中藥對細菌分裂周期的影響至關重要。本研究旨在研究臨床常用抑菌中藥“銀花泌炎靈片”體外抑菌活性的基礎上，以KCs法繪制抑菌曲線，分析藥物對細菌分裂周期的影響，以初步揭示“銀花泌炎靈片”的抑菌機理。

本研究結果表明銀花泌炎靈片95%乙醇提取物對大腸埃希菌標準菌株ATCC 25922和20株泌尿系統感染患者大腸埃希菌臨床分離株都具有一定的抑菌活性。KCs研究發現銀花泌炎靈片95%乙醇提取物延遲了大腸埃希菌的分裂時間，使大腸埃希菌生長周期中的對數生長期延長，并加速進入衰退期，從而抑制了細菌的生長繁殖。由于該藥為中藥復方制劑，藥物中的單體化學成分眾多，具體是哪一種成分或幾種成分的聯合抑菌作用，還有待于進一步研究。

[1]Almeida AA,Farah A,Silva DA,et al.Antibacterial activity of coffee extracts and selected coffee chemical compounds against enterobacteria[J].J Agric Food Chem,2006,54(23):8738.

[2]田應彪,陳澤慧,楊名慧,等.16 種中藥水煎液對MRSA 和MSSA 體外抑菌試驗觀察[J].中國醫院藥學雜志,2009,29 (11):897-899.

[3]陳澤慧,田應彪,李丹丹,等.五味子,石榴皮等中藥對鮑曼不動桿菌體外的抑菌作用[J].中國醫院藥學雜志,2011,31(15):1248-1251.

[4]Jyh-Ferng Yang,Cheng-Hong Yang,Hsueh-Wei Chang.Chemical Composition and Antibacterial Activities of Illicium verum Against Antibiotic-Resistant Pathogens[J].Journal of medicinal food,2010,13(5):1254-1262.

[5]Guoxing Liu,Jun-Chao Liang,Xue-Lin Wang.In Vitro Synergy of Biochanin A and Ciprofloxacin against Clinical Isolates of Staphylococcus aureus[J].molecules,2011(16):6656-6666.

[6]李 娟,李曉東,楊麗霞,等.單味中藥體外抑菌活性的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2011,17(11):283-286.

Preliminary study of antibacterial mechanism of Yinhua Miyan Ling Tablet on Escherichia coli by KCs method

HU Ya, WANG Ji-han, ZHANG Xiao-tian, WANG Huai-dong, ZHAO Chun-yan, WANG Fang＊
(Norman Bethune College Medicine Jilin University,Changchun,Jilin 130021,China)

Yinhua Miyan Ling Tablet;E. coli; Antibacterial activity;Minimum inhibitory concentration;Antibacterial mechanism

R285

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2012.08.001.003.02

2012－03－02

胡 亞（1985－），女，碩士研究生，主要從事藥理學研究。

*王 放，男，副教授，吉林大學白求恩醫學院。

(本文編輯: 李新剛)