克氏螯蝦蝦殼Protamex 蛋白酶水解物的抗氧化活性*

李松林

1(淮陰工學院 生命科學與化學工程學院，江蘇 淮安，223003)

2(南京大學 淮安高新技術研究院，江蘇淮安，223003)

利用克氏螯蝦(Procambarus clarkii)生產1 t蝦仁約會產生5～6 t的下腳料——蝦殼［1］。蝦殼中含有20%～30%的甲克素，20% ～30%的蛋白質等有機物，以及30% ～40%的鈣等無機物［2］。如果不對蝦殼進行處理，既造成了資源的浪費，又導致污染環境。食品蛋白質經過酶水解，可以在不影響營養價值的前提下提高或者改進蛋白質的功能特性［3］。水解產生的多肽不僅可以提高生物體對蛋白質的進一步消化吸收，而且可以獲得抗氧化活性肽。

自由基是有機體正常新陳代謝的產物，過量的自由基會引起脂質的過氧化而導致嚴重的疾病，如癌癥、風濕性關節炎和衰老等［4］。由于化學合成抗氧化劑可能具有潛在的毒性，因此人們更加關注天然抗氧化劑的開發與應用［5］。本研究運用Protamex蛋白酶對克氏螯蝦蝦殼進行水解，對蝦殼蛋白肽(CSPH)的DPPH·清除能力，ABTS·+清除能力，OH·清除能力，還原能力和Fe2+螯合力進行研究。同時對水解物的分子質量分布與抗氧化性之間的關系進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

克氏螯蝦蝦殼，江蘇淮安盱眙縣;Protamex蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司;菲洛嗪，丹麥諾維信公司;DPPH(二苯代苦味酰基自由基)，GSH(谷胱甘肽)，ABTS［2，2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽］，美國Sigma-aldrich公司;其他試劑均為分析純。

HH-600數顯恒溫水浴鍋，UV752N紫外可見分光光度計，上海精科實業有限司;FreeZone 6L真空冷凍干燥機，美國Labconco公司;FA-2104N電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司;éppendorf 5430臺式高速離心機，艾本德中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蝦殼蛋白肽的制備工藝

蝦殼→干燥→研磨→蝦殼粉→脫脂蝦殼→堿提酸沉→離心→沉淀物真空冷凍干燥→蝦殼蛋白→酶解→滅酶(100℃水浴10 min)→離心(10 000 r/min，30 min)→上清液→濃縮→真空冷凍干燥→蝦殼蛋白肽

其中酶解條件為:酶∶底物=1∶500，蝦殼粉∶水=1∶7，溫度 55℃，pH7.0，時間 320 min。

1.2.2 蝦殼蛋白肽抗氧化功能評價

DPPH·清除能力測定［6］，ABTS·+清除能力的測定［7］，OH·清除能力的測定［8］，還原能力測定［9］，Fe2+螯合力測定［10］。

1.2.3 水解物的分子質量分布

采用高效凝膠滲透色譜法測定，色譜柱:TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm×30 cm)。洗脫液:V(水)∶V(乙腈)∶V(三氟乙酸)=55∶45∶0.1)。柱溫為室溫，流速為0.5 mL/min。檢測波長:220 nm。制作標準曲線的標準樣品:Gly-Gly-Gly(189 Da)，Gly-Gly-Tyr-Arg(451 Da)，桿菌肽 (1450 Da)和細胞色素C(12 384 Da)。

2 結果與分析

2.1 還原力

還原力通常用來評價抗氧化劑作為電子供體提供電子或者氫原子的能力［6］。具有還原力的物質可以減少脂質過氧化反應過程的氧化中間物［11］。如圖1所示，蝦殼蛋白肽的還原力隨著濃度的增加而增強，并且具有較好的線性關系(y=0.122 9x-0.035 6，R2=0.994 3，P ＜0.05)。Yang等人發現，金槍魚頭的蛋白水解物的還原力同樣隨著蛋白肽濃度的增加而增強，并具有良好的線性關系［12］。蝦殼蛋白肽在濃度為3.0 mg/mL時，吸光度值為0.33。Jia等人研究發現阿拉斯加鱈魚皮蛋白水解物在濃度為3.0 mg/mL 時，吸光度值為 0.2［13］。

圖1 蝦殼蛋白肽的還原能力

2.2 Fe2+螯合力

過渡態金屬，例如Fe2+，通過螯合作用可以延遲過氧化反應，進而阻止食品的酸敗［14］。如圖2所示，蝦殼蛋白肽Fe2+螯合力隨著濃度的增大而增大。在濃度為2 mg/mL時，蝦殼蛋白肽(CSPH)的螯合率為22.3%而EDTAD的螯合率則為79.9%。但是當濃度值超過10 mg/mL時，兩者的螯合力趨于一致。Yaowapa等人通過研究證明圓竹莢魚蛋白的水解物同樣具有一定的螯合活力［15］。

圖2 蝦殼蛋白肽的Fe2+螯合能力

2.3 對DPPH·的清除能力

DPPH·清除實驗被廣泛應用于測定蛋白水解物的抗氧化性［16］。當DPPH·遇到質子供體時，例如具有抗氧化能力的物質，自由基將被清除，同時吸光值下降［13］。如表1所示，對CSPH在不同濃度下的DPPH·清除活力進行了測定，同時使用GSH作為自由基清除的對照。蝦殼蛋白肽的自由基清除活力隨著濃度的增加而增加，同時具有良好的線性關系(y=50.48x+7.027 3，R2=0.982 1，P ＜0.05)。Dong等人同樣發現了牡蠣肉蛋白肽的濃度與DPPH·清除活力之間具有線性關系［17］。通過實驗發現，GSH具有更強的清除自由基活力，其IC50=0.76 mg/mL，而蝦殼蛋白肽的IC50=0.85 mg/mL。這是由于GSH本身為強抗氧化劑。而蝦殼蛋白肽是由不同的多肽組合而成。其中某些分子質量范圍的多肽可能具有較強的抗氧化性，然而其中可能還包括某些多肽只有較弱的抗氧化性，甚至不具有抗氧化性活力。

2.4 對ABTS+·的清除能力

對ABTS+·的清除能力以電子轉移和氫原子轉移為基礎，被廣泛應用于評價抗氧化活力［18］。如表1所示，蝦殼蛋白肽濃度與ABTS+·的清除能力之間存在著線性增加的關系(y=47.6x+8.507 8，R2=0.986 8，P＜0.05)。與DPPH·清除能力相似，蝦殼蛋白肽的IC50(0.87 mg/mL)大于GSH的IC50(0.44 mg/mL)。與蝦殼蛋白肽相似，Zhu等人發現，小麥蛋白水解物的ABTS+·的清除能力同樣隨著蛋白肽的濃度增加而增加［19］。

2.5 對羥自由基(OH·)清除能力

OH·壽命較短，但具有較強的反應性，只能與鄰近的分子發生反應，對機體具有較大的危害性［20］。表1中比較了蝦殼蛋白肽和GSH在濃度0.2～1.2 mg/mL對OH·的清除能力。由表1可見，隨著濃度的增大，蝦殼蛋白肽和GSH對OH·清除能力均增大。在濃度相同時，二者對羥基自由基的清除能力存在顯著性差異(P＜0.05)。在濃度為1.0 mg/mL時，蝦殼蛋白肽的自由基清除能力為65.82%，而GSH則為79.16%。

2.6 蝦殼蛋白水解物分子質量分布

分子質量是反應蛋白水解的重要參數，與蛋白水解物的生物活性密切相關［21］。Wang發現抗氧化性取決于水解物的分子質量分布。如圖3和表2所示，92.79%的蝦殼蛋白水解物的分子質量小于1 000 u。這說明水解物中包含了大量的低分子量多肽。這些低分子量多肽主要由分子質量范圍在180～500 u的多肽組成(50.51%)。Sitthipong等報道了來源于虹色金線魚蛋白水解物的低分子量多肽具有較強的抗氧化能力。其中1個1.3 kDa的肽段展示出最強的ABTS自由基清除能力［22］，說明分子質量對抗氧化性具有顯著的影響。

表1 蝦殼蛋白肽對DPPH·、ABTS+·和OH·的清除能力

圖3 蝦殼蛋白水解物的分子質量分布

表2 蝦殼蛋白水解物的分子量分布

3 結論

蝦殼蛋白肽的還原能力和自由基清除能力隨肽濃度的增大而增大。Fe2+螯合力同樣與蛋白肽的濃度之間存在著量效關系，但是當濃度達到10 mg/mL時，螯合力不再繼續增大。通過對蛋白肽的分子質量分布進行研究發現，92.79%的多肽的分子質量小于1 000 u，其中21.50%的多肽分子質量小于180 u，50.51%的多肽分子量為180～500 u，20.78%的多肽分子質量為500～1 000 u。

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