鱷魚骨雙酶酶解產物的功能特性及其抗氧化活性

范鴻冰，陳孫福，洪惠，羅永康

1(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京，100083)

2(廣西盟展鱷魚科技開發有限公司，廣西南寧，530028)

鱷魚(crocodile)是一種從中生代至今生長的脊椎類兩棲爬行動物，與已滅絕的恐龍是近親，是最古老的爬行動物，在地球上已生存了2億3千多萬年，具有“活化石”之稱［1］。鱷魚全身都是寶，如鱷魚肉含有豐富的優良蛋白質和人體必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素和多種微量元素。鱷魚肝有補腦、生新血、去濕氣之功。食用鱷魚肝可解毒明目，養血益腎，對肝功能欠佳和視力不好者，都具有明顯的食療作用，同時還可以抑制結石的生成［2］。鱷魚骨可防治風濕骨痛，骨粉含有大量的活性鈣及磷等物質，可用于防治老年骨質疏松癥、小兒軟骨癥等［1］。鱷魚尾膠，不但能滋補肝腎，益氣固本，增強細胞活力，而且能護膚養顏，增加皮膚彈性，減少和延緩皺紋的早現，對過敏癥也有滿意效果［3］。但目前各地對鱷魚的商業利用多集中在皮革、食用方面，在醫療保健和藥用價值的開發利用還比較薄弱，缺乏深入的基礎研究，尚未形成規范的產品。目前國內外對鱷魚的研究較少，關于鱷魚骨蛋白酶解產物的功能特性及抗氧化性的研究更是鮮有報道。

本試驗以養殖鱷魚魚骨為原料，采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶及雙酶混合使用對其進行酶解，并測定了酶解產物的功能特性及抗氧化性，為鱷魚魚骨的深入研究和進一步廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鱷魚魚骨，由廣西盟展鱷魚科技開發有限公司提供。

堿性蛋白酶，丹麥NOVO公司;木瓜蛋白酶，廣西南寧龐博生物工程有限公司;三硝基苯磺酸(TNBS)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、啡咯嗪，美國Sigma公司;其他試劑均為化學分析純。

UNICO-2007分光光度計，美國Unic公司;DS-1高速組織搗碎機，上海標準模型廠;TGL-16A臺式高速冷凍離心機，上海安亭科技儀器廠;FE20梅特勒-托利多實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FD-1PF冷凍干燥機，北京德天佑科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鱷魚骨基本組成成分的測定

蛋白質含量的測定:凱氏定氮法(GB5009.5-2010);粗脂肪含量的測定:索氏抽提法(GB/T5009.6-2003);水分含量的測定:直接干燥法(GB5009.3-2010);灰分含量的測定:550℃灼燒法(GB5009.4-2010)。

1.2.2 鱷魚魚骨蛋白酶解產物的制備工藝

鱷魚魚骨→洗凈→剁塊→絞碎→高溫蒸煮(121℃、20 min)→干燥(105℃、8 h)→二級粉碎→與去離子水混合(質量體積比1∶10(g/mL))→調溫度、pH后加蛋白酶酶解(酶與底物質量比3.87 g/kg，木瓜蛋白酶酶解4 h［pH7.0，60℃)、堿性蛋白酶酶解4h(pH8.0，60℃)、雙酶(0～1 h內木瓜蛋白酶酶解、滅酶、加入堿性蛋白酶酶解3h)］→滅酶(100℃，10 min)→離心(10 000 r/min，10 min)→取上清液→冷凍干燥→鱷魚魚骨蛋白酶解產物

1.2.3 水解度的測定

參考 Alder-Nissen［4］和 Spellman 等［5］的三硝基苯磺酸法(trinitribenzenesulfonic，TNBS)。

1.2.4 抗氧化性的測定

1.2.4.1 亞鐵離子螯合能力的測定［6］。

取蛋白質濃度為5 mg/mL酶解產物待測液1.0 mL與3.7 mL 99.5%的無水乙醇及0.10 mL 2×10-3mol/L FeCl2混勻，加入0.20 mL 5×10-3mol/L啡咯嗪啟動反應，室溫下靜置20 min，并于562 nm處測定吸光度。對照組以1 mL去離子水代替酶解產物溶液。亞鐵離子螯合能力的計算:

式(1)中:A樣品和A對照分別表示樣品反應液和對照溶液在562 nm下的吸光度。

1.2.4.2 清除DPPH自由基能力的測定［7］。

取蛋白質濃度為5 mg/mL的酶解產物待測液1.50 mL與1.50 mL濃度為99.5%的無水乙醇混勻，加入0.375 mL 0.02%(質量分數)的DPPH乙醇溶液振蕩混勻。室溫下暗室反應60 min后在517 nm處檢測反應液的吸光度。清除DPPH自由基能力計算公式:

式(2)中:A樣品和A對照分別表示樣品反應液和對照液在517 nm下測得的吸光度。

1.2.4.3 還原力的測定［8］。

取蛋白質濃度為5 mg/mL酶解產物待測液1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL 1%(質量分數)的 K3［Fe(CN)6］溶液混勻，50℃水浴20 min后急速冷卻，加入2.5 mL10%(質量分數)TCA(三氯乙酸)，充分混勻后3 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水及0.50 mL 1%(質量分數)的FeCl3充分混勻，室溫反應10 min后于700 nm測其吸光值。

1.2.5 功能特性的測定

溶解性:根據李雪等［9］的方法測定。

熱穩定性:根據李雪等［9］的方法測定。

乳化性:參考Pearce等［10］的方法測定。

2 結果與分析

2.1 鱷魚骨基本成分組成

表1 鱷魚骨基本成分組成(ˉX±S)

2.2 水解度

鱷魚魚骨蛋白酶解后，不同酶解時間的水解度變化如圖1所示。木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物均在酶解過程最初的0.5 h內酶解水解度上升較快，而后隨酶解時間的延長水解度變化逐漸減小，這與李雪［9，11］等的研究結果類似。堿性蛋白酶酶解產物在酶解0.5 h以后，水解度顯著高于木瓜蛋白酶酶解產物的水解度(P＜0.05)。雙酶酶解產物水解度在1 h內變化與木瓜蛋白酶酶解產物一致，在1～2 h內堿性蛋白酶作用下，水解度上升較快，而后隨酶解時間的延長水解度變化逐漸減小。這可能是由于隨著酶解體系中游離氨基酸含量不斷增大，蛋白酶的酶解作用逐漸受到抑制，水解度變化逐漸減小。

2.3 抗氧化性

圖1 鱷魚骨蛋白水解過程中水解度隨時間的變化

2.3.1 亞鐵離子螯合能力

鱷魚魚骨蛋白經酶解后，不同酶解時間的酶解物的亞鐵螯合能力如圖2所示。由圖2可知，在0～2 h內堿性蛋白酶酶解產物的亞鐵離子螯合能力均顯著大于木瓜蛋白酶酶解產物和雙酶酶解產物(P＜0.05)。隨著酶解時間的延長，雙酶酶解產物的亞鐵離子螯合能力逐漸增大并最終趨于平穩，在2～4 h內雙酶酶解產物和堿性蛋白酶的亞鐵離子螯合力則沒有顯著性差異(P＞0.05)，且二者均顯著大于木瓜蛋白酶(P＜0.05)。本試驗也表明木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產物均具有增強螯合亞鐵離子的能力，采用雙酶酶解得到的酶解產物與堿性蛋白酶酶解產物相似，明顯優于木瓜蛋白酶酶解產物。

圖2 酶解時間對鱷魚骨酶解物亞鐵離子螯合能力的影響

2.3.2 清除DPPH自由基能力

鱷魚魚骨蛋白經酶解后，不同酶解時間的酶解物清除DPPH自由基的能力如圖3所示。由圖3可知隨著酶解時間的延長，3種酶解產物的清除DPPH自由基能力較0.25 h都有所下降，在2～4 h內相同酶解時間下，雙酶酶解產物清除DPPH自由基能力顯著大于木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產物(P＜0.05)。因此，采用雙酶酶解較單獨使用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶得到的酶解產物具有更好的清除DPPH自由基的能力，同時該實驗也表明了木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物都具有清除DPPH自由基的能力。

圖3 酶解時間對鱷魚骨酶解物清除自由基能力的影響

2.3.3 還原力

鱷魚魚骨蛋白經酶解后，不同酶解時間的酶解物的還原力如圖4所示。由圖4可知，相同酶解時間下，0～1 h內3種酶解產物的還原力沒有顯著性差異(P＞0.05)，但隨著酶解時間的延長，2～4 h內雙酶酶解產物的還原力均大于木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產物(P＜0.05)，而木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物則沒有明顯區別。本試驗結果不僅表明了木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶酶解產物具有增強還原力的作用，同時也證明了較單一酶酶解而言，雙酶酶解得到的酶解產物具有更好的增強還原力的作用。

圖4 酶解時間對鱷魚骨酶解物還原力的影響

2.4 功能特性

2.4.1 溶解性

不同條件下的鱷魚骨酶解產物的溶解性見表2。可以看出，酶解產物經酶解之后溶解性良好，其中雙酶酶解產物在pH 7時的溶解性均大于84.34%，最高達到97.02%，可能是因為雙酶酶解使蛋白質大分子電離出更多的親水基團和離子基團，其數量與蛋白質的水合作用程度有關。相同的酶解條件下的酶解產物，在0.25～4.00 h內pH 7時不同酶解時間下酶解產物的溶解性均大于 pH 4時的溶解性(P＜0.05)，Quaglia等［12］指出，pH 值會影響酶解產物肽段的靜電荷數量從而導致溶解性的變化。同時，相同水解度下，在2.00～4.00 h內的雙酶酶解產物在pH 4和pH 7下顯著大于木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶酶解產物(P＜0.05)。

2.4.2 熱穩定性

酶解產物的熱穩定性是衡量其是否適于在食品中應用的一個重要指標［11］。不同條件下的鱷魚骨酶解產物經熱處理后的溶解性見表3。可以看出，酶解產物經93℃，10 min熱處理之后溶解性略有下降，但熱穩定性仍然良好。其中雙酶酶解產物在pH 7下熱處理后溶解性均大于77.38%。這可能是由于蛋白質經酶解后肽鏈展開，親水-疏水平衡得到改善，更易于水分子形成氫鍵，所以熱處理之后分子之間不容易聚集，仍可保持較高的溶解性［13］。

表2 不同條件下鱷魚骨酶解產物的溶解性

表3 不同條件下鱷魚骨酶解產物的熱穩定性

2.4.3 乳化性

蛋白質的乳化性是指蛋白質能使水油結合在一起，形成穩定的乳狀液的性能［14］，乳化活性表征乳化體系分散相的分散程度及相界面的界面比，反映乳化體系維持兩相穩定存在的能力。不同酶解時間下的鱷魚骨酶解產物的乳化性見圖5。隨著酶解時間的延長，堿性蛋白酶酶解產物的乳化性呈下降趨勢。而在0.25～3.00 h內木瓜蛋白酶及雙酶酶解產物的乳化性分別在1.0 h和2.0 h達到最大，這可能是因為蛋白質被酶解后，分子內部的疏水殘基暴露，蛋白質在油-水界面吸附、擴散能力提高，乳化能力增強。隨后其乳化性減小，這可能是由于其酶解產物中小分子的肽和氨基酸增多，不利于蛋白質在油-水界面的擴散和吸附，導致乳化性的下降［15］。相同酶解時間下，雙酶酶解2.0 h和3.0 h得到的產物的乳化性顯著高于其他組(P＜0.05)。

圖5 酶解時間對鱷魚骨水解產物乳化活性指數指數的影響

3 結論

(1)鱷魚魚骨蛋白酶解產物的抗氧化性受酶解時間及蛋白酶種類的影響，采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶雙酶酶解產物的抗氧化性較強，具有作為天然抗氧化劑的潛力。

(2)采用此種雙酶酶解法酶解鱷魚骨，在溫度60℃和pH7.0條件下，按酶底物比3.87 g/kg加入木瓜蛋白酶酶解1 h后，100℃滅酶10 min，于60℃調節pH8.0后加入堿性蛋白酶酶解1h得到的酶解產物具有較好的抗氧化性和功能性質，可以考慮取該條件下的酶解產物制備抗氧化劑應用于食品工業。

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