β-甘露聚糖酶高產菌株發酵條件優化

曲麗娜，王瑞明，肖靜，唐衛華，孫紅梅

1(山東輕工業學院食品與生物工程學院，山東濟南，250353)2(山東省微生物工程重點實驗室，山東濟南，250353)

β-甘露聚糖酶(β-1，4-D-mannan mannohydrolase，EC 3.2.1.78)是一種能水解均一甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的主鏈β-1，4-D-甘露糖苷鍵的半纖維素酶，主要來自于微生物［1-2］。作為一種新型工業用酶，目前存在著發酵酶活力偏低的缺陷，導致其生產和應用成本較高，限制了該酶的廣泛應用［3］。

本研究所用菌株Bacillus sp.QYW-1(登錄號:JX524224)在單因素優化條件下進行發酵生產，15～16h產酶活力即達到最高，其發酵周期比已報道的芽孢桿菌屬其它菌株周期明顯縮短，已報道的最短發酵周期為20h左右。Akino等［4］報道的Bacillus sp.AM-001 周期為 24h，Bacillus stearothermophilus 2004［5］和Bacillus sp.N-6［6］的發酵周期分別為 12h 和 18h。該菌株產生的β-甘露聚糖酶與同類其他來源的酶相比具有良好的熱穩定性和pH適應性。由于野生菌株產酶活力較低，需要進一步優化培養基及培養條件。Plackett-Burma(PB)實驗設計是進行培養基及培養條件優化的常用方法。此方法可以從眾多影響因素中快速有效地篩選出最為有效的幾個因素［7］。本研究以篩選獲得的Bacillus sp.QYW-1為出發菌株，在單因素優化的基礎上，確定對產酶活力影響最顯著的因素;采用響應面(Response Surface Methodology，RSM)找出影響β-甘露聚糖酶產酶的最佳條件，從而達到對菌株Bacillus sp.QYW-1的產酶條件的優化。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗菌株:本實驗室自行篩選獲得的Bacillus sp.QYW-1。

發酵培養基(經單因素實驗優化獲得):魔芋粉20 g/L，蛋白胨 10 g/L，MgSO45 g/L，NaCl 10 g/L，KCl 6 g/L，NaNO35 g/L，K2HPO44 g/L。

1.2 β-甘露聚糖酶的制備與檢測

接6%的種子液(濃度109CFU/mL)于發酵培養基中，37℃，180 r/min培養 15 ～16 h ，8 000 r/min、4℃離心10 min，得粗酶液。

DNS法測定 β-甘露聚糖酶酶活［8］:底物為5 g/L的刺槐豆膠，55℃下反應20 min。酶活力定義為上述條件下產生1 μmol還原糖(甘露糖)所需要的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.3 Plackett-Burman(PB)實驗

選用實驗次數N=12的實驗設計，選取單因素優化實驗中對菌株產酶影響較大的培養基的7個組分和培養條件中的1個因素，如下:魔芋粉，NaCl，NaNO3，KCl，接液量，MgSO4，K2HPO4，蛋白胨以及 3個虛擬因素X9、X10、X11等11個因素進行考察，每個因素取高低2個水平，低水平即“-”，高水平即“+”，高水平約為低水平的1.5倍，以β-甘露聚糖酶的酶活力Y(U/mL)為響應值，共進行12次實驗以確定每個因素的影響因子。［7］

在Plackett-Burman(PB)實驗設計中，運用線性函數進行因素篩選，忽略交互作用的影響［7］，線性模型方程見式(1)。

式中:Y為β-甘露聚糖酶酶活力;xi為考察因素;βi是回歸系數，與xi的影響程度有關。單一因素的影響由方程(2)計算:

式中:E(xi)是所考察因素的影響水平，Mi+和Mi-為因素i在實驗中所測得的酶活力達到最大值和最小值時的數值;N為實驗次數。

具體設計見表1，其結果進行方差分析，選取可信度大于95%以上的因素作為影響菌株產β-甘露聚糖酶的主要因素。

表1 Plackett-Burman(PB)實驗設計及因素水平

1.4 最陡爬坡實驗設計

根據PB實驗所得到的3個重要因素的效應大小的比例設定它們的變化方向及步長進行實驗，其余因素的根據各因素效應的正負、大小以及單因素實驗結果，正效應的因素取高水平濃度，負效應的因素取低水平濃度，迅速的逼近最佳產酶活力區域以建立有效的響應面擬合方程［9］。

1.5 Box-Behnken響應面優化實驗

根據PB實驗及最陡爬坡實驗結果，選取的每個因素設計3個水平。根據相應的實驗設計進行實驗后，分析過程中對實驗結果采用二階經驗模型對數據進行擬合，得到帶交互項和平方項的回歸分析模型，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定的水平范圍內可求出最佳值。其回歸模型(3):

式中:Y 是 β-甘露聚糖酶酶活力;β0、βi、βii依次是偏移項、線性偏移和二階偏移系數;βij是交互效應系數;Xi、Xj是各因素水平值。

回歸方程分別對各自因素水平值求偏導數可得到響應面回歸函數的駐點，即可得到實驗范圍內的最佳產酶培養基組分濃度。根據PB實驗結果及最陡爬坡實驗結果，3因素的選取水平見表2。其余因素的根據各因素效應的正負、大小以及單因素實驗結果，正效應的因素取高水平濃度，負效應的因素取低水平濃度。

表2 響應面三因素實驗水平

1.6 產酶最佳條件驗證實驗

根據BB實驗及Design Expert對回歸方程在實驗范圍內產酶最佳條件的預測培養基組分濃度，進行產酶活力驗證實驗，實驗數據取3次試驗結果的平均值，與回歸模型的預測值進行比較分析。

2 結果和分析

2.1 Plackett-Burman(PB)實驗設計結果與分析

PB實驗設計結果見表3。運用Design Expert軟件對表1中的β-甘露聚糖酶活力進行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數及顯著性(表4)。

表3 Plackett-Burman(PB)實驗設計結果

方差分析模型的Prob(P)＞F值為＜0.0001，為高度顯著，表明該模型在所得回歸區域擬合很好;負相關系數R2=0.932 0，說明相關性較好，校正決定系數Adj R2=0.906 5;通常情況下變化系數CV越低，實驗的可行度和精確度越高，此實驗中CV值等于3.93，表示PB實驗的可信度和精確度良好，精密度(Adeq precision)是有效信號與噪聲的比值，大于4.0視為合理，該實驗中精密度達到17.784。回歸方程的方差分析見表5。

表4 β-甘露聚糖酶產酶活力回歸模型方差的方差分析

表5 Plackett-Burman(PB)實驗偏回歸系數的顯著性分析

以因素X1魔芋粉添加量為例:其偏回歸系數是10.21，標準誤差是1.48，影響水平為E(x1)=20.43，表明因素X1對β-甘露聚糖酶產酶活力的影響為正效應，即隨著魔芋粉添加量的增加，酶活呈增加趨勢，因此在后繼因素優化試驗中應提高魔芋粉的添加量，因素X1的平方和百分值是40.68%，較之其他因素的相應值明顯較高，因此顯著性分析結果最為重要。由表7可明顯看出因素X1(魔芋粉添加量)、X6(MgSO4添加量)、X8(蛋白胨添加量)為主要影響因子，其影響值分別是40.68%、15.40%、37.12%，而3個虛擬因素 X9、X10和 X11對影響值 (0.0019%、2.51%、0.17%)較低，表明了該線性模型的適用性。經影響因素篩選，得到以酶活為響應值的線性回歸方程

式中:X1=(魔芋粉 -22)/2;X6=(MgSO4-4.5)/0.5;X8=(蛋白胨-13.5)/1.5

通過方差分析，魔芋粉、蛋白胨和MgSO43個因素的可信度均大于95%，對β-甘露聚糖酶產酶活力的影響最為顯著，選擇這3個因素進一步作最陡爬坡實驗和RSM實驗。其中魔芋粉高水平好，其它兩個因素低水平好。其余因素的根據各因素效應的正負、大小以及單因素實驗結果，正效應的因素取高水平濃度，負效應的因素取低水平濃度。

2.2 最陡爬坡實驗結果

根據3個重要因素的效應值及單因素實驗結果設定，魔芋粉為正方向，步長為2 g/L;蛋白胨與Mg-SO4為負方向，步長分別為1 g/L、0.1 g/L。最佳產酶培養基組成在實驗2與4之間(表6)。

表6 最陡爬坡實驗設計與結果

2.3 Box-Behnken優化設計結果與響應面分析

通過對A:魔芋粉、B:蛋白胨、C:MgSO4進行中心組合設計(表7)，并利用Design-expert軟件對Box-Behnken實驗數據進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程為:

式中:R為響應值，即β-甘露聚糖酶酶活力;A、B、C分別為魔芋粉、蛋白胨、MgSO4添加量。

表7 RSM實驗方案與結果

試驗編號 因素A魔芋粉 B蛋白胨 C MgSO4響應值酶活/(U·mL-1)12 0 + + 142.34 13 0 0 0 227.08 14 0 0 0 231.74 15 0 0 0 229.82

響應面分析中對Box-Behnken實驗結果進行擬合二次模型方差分析如表8。分析結果表明，回歸方程的多元相關系數R2=98.82%，校正決定系數Adj R2=96.70%，說明回歸方程擬合程度良好。方差分析得知，Prob(P)＞F值為0.000 3(＜0.05為模型顯著)，表明該回歸模型高度顯著，可以用來進行相應值預測。魔芋粉添加濃度對菌株產β-甘露聚糖酶酶活力具有正效應，P=0.029 9;其次為蛋白胨和Mg-SO4，P值分別為0.041 4和0.049 0(皆＜0.05)為顯著;而失擬項P=0.067 0(＞0.05)不顯著，說明回歸顯著;交互項 AB、AC的 P值分別為 0.000 7和0.0013，為顯著;交互項BC不顯著，P=0.436 1。

表8 中心組合設計二次模型方差分析

2.4 回歸模型的優化

交互項BC(P＞0.05)對菌株產酶影響不顯著，因此采用手動優化的方法對回歸模型進行優化，優化的結果見表9。經手動優化后的回歸方程為:

表9 去掉交互項BC后的優化結果

由表9可知，失擬項不顯著(P=0.0775＞0.05)，而模型的P＜0.000 1，表明模型高度顯著;同時軟件分析的復相關系數R2為98.65%，校正后的Adj R2=0.968 6，表明該模型的擬合程度良好，實驗誤差小，該模型是合適的，可以用此模型對菌株Bacillus sp.QYW-1產β-甘露聚糖酶進行分析和預測;在實驗所選取的因素水平范圍內，各因素對產酶活力的影響排序為魔芋粉＞蛋白胨＞MgSO4。

利用Design-Expert對經手動優化后的回歸方程中的交互項AB和AC繪制響應面分析圖和等高圖，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著，圓形表示兩因素交互作用微弱，如圖1和圖2所示。

圖1 魔芋粉A和蛋白胨B對菌株產酶交互影響響應面圖及等高圖

圖2 魔芋粉A和MgSO4C對菌株產酶交互影響響應面圖及等高圖

圖1 為MgSO4為3.77 g/L條件下，魔芋粉添加量與蛋白胨添加量的交互影響。當確定魔芋粉添加量不變時，隨著蛋白胨添加量的增加，酶活力出現了先增大后減小的趨勢。同樣，固定蛋白胨的添加量，隨著魔芋粉添加量的增加，酶活力業出現先增大后逐漸降低的趨勢。圖2為蛋白胨添加量為10.26 g/L條件下，魔芋粉和MgSO4添加量的交互影響。當確定其中一個因素的添加量不變時，隨著另一因素添加量的增加，酶活力出現了先增大后減小的趨勢。上述兩圖的響應面圖呈鐘罩型，說明兩者的交互作用比較顯著，與表9的結果一致(P值小于0.05)。

2.5 最佳發酵條件的預測與驗證

通過Design Expert軟件對經手動優化后的回歸方程求解，在試驗的因素水平范圍內預測菌株產β-甘露聚糖酶發酵的最佳條件為:魔芋粉添加量26.51 g/L，蛋白胨添加量10.27 g/L，MgSO4添加量3.77 g/L，由于實驗操作的可行性，將發酵的最佳條件修正為魔芋粉26 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO43.8 g/L，(其他條件:NaCl 10 g/L，KCl 6 g/L，NaNO36 g/L，K2HPO43 g/L，接液量6%)。在此條件下進行3次驗證實驗，測得甘露聚糖酶酶活力為233.86 U/mL，與理論預測值231.475 U/mL的相對誤差很小，說明經手動優化后的回歸方程對Bacillus sp.QYW-1產β-甘露聚糖酶進行的分析和預測非常可靠。

3 結論

對菌株進行16S rRNA基因序列測序結果顯示與 Bacillus amyloliquefaciens strain CICC 23753、Bacillus subtilis isolate WL-3、Bacillus subtilis strain K-C-6 等同源性較高，同源性達99%，可判斷該菌株為芽孢桿菌屬。利用PB實驗篩選獲得影響該菌株產β-甘露聚糖酶產酶活力的重要因素為魔芋粉、蛋白胨、Mg-SO4。根據最陡爬坡實驗和Box-Behnken實驗結果得到的回歸方程，并根據實際操作可行性優化得到最佳產酶培養基組成為:魔芋粉26 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO43.8 g/L，NaCl 10 g/L，KCl 6 g/L，NaNO36 g/L，K2HPO43 g/L，接液量6%。在此條件下進行3次驗證試驗，實驗結果與理論預測值高度吻合，相對誤差很小，β-甘露聚糖酶產酶活力由單因素優化結果的115.62 U/mL提高到233.86 U/mL，提高了102%，是野生菌株的最初酶活21.85 U/mL的10.7倍。

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