以紅三葉鮮青草預加工廢水發酵培養蘇云金芽孢桿菌

曾家豫，趙靜，孔維寶，劉雄雄，武偉國，葸玉琴，楊紅

(西北師范大學生命科學學院，甘肅 蘭州，730070)

紅三葉草(紅三葉，T.pratense)又名“紅車軸草”、“紅荷蘭翹搖”，屬多年生草本植物［1］，分布于歐洲、美國及新西蘭，中國淮河以南亦有栽培。紅三葉草是畜禽的優質飼料，產草量高，可用于發展畜牧業。含有多種異黃酮類物質，占其干重的0.5% ～3.5%［2］，高于其他豆類10～30倍。紅三葉草及其制劑具有防治乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和改善骨質疏松［3-4］、以及女性更年期癥狀等作用［5-6］，是極有前途的天然保健食品［7］。

紅三葉鮮青草預加工廢水是為了提取紅三葉草中的異黃酮類物質［8-9］，將新鮮的紅三葉草通過一系列機械擠壓和清洗等操作而加工成紅三葉草干草的過程中產生的廢水，目前，這些廢水大多直接排放，不僅污染環境，而且浪費資源。因此，如何對其進行凈化處理和有效利用成為亟待解決的問題。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)制劑是當前應用最廣、最有效的微生物殺蟲劑［10］。Berliner［11］于1911年首先從德國地帶的一批被感染的地中海粉螟中分離得到該菌，屬于革蘭氏陽性土壤桿菌，在芽孢形成過程中產生稱為δ-內毒素的殺蟲伴孢晶體蛋白，具有很高的殺蟲活性［12-13］。同時，研究人員發現，其在芽孢形成前的營養生長階段，可分泌另外一種非δ-內毒素的殺蟲蛋白，即Vip蛋白(vegetative insecticidal protein)，它是很有應用前景的殺蟲蛋白，被稱為第二代殺蟲蛋白［14-15］。

本文以紅三葉鮮青草預加工廢水為原料，制備蘇云金芽孢桿菌發酵培養基，發酵培養蘇云金芽孢桿菌。以期探索研究一種紅三葉鮮青草預加工廢水凈化處理和資源化利用的新方法。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料與試劑

紅三葉鮮青草預加工廢水，取自甘肅岷縣方正草業開發有限公司。

ACCC01607-蘇云芽孢桿菌(Bt)，購于廣東微生物所菌種保藏中心;牛肉膏，酵母粉，蛋白胨，瓊脂;葡萄糖、NaCl、K2HPO4、MnSO4·H2O、CaCO3等，均為分析純試劑。

1.2 培養基

瓊脂培養基:蛋白胨 5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，儲存備用。

種子液體培養基:蛋白胨5 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，用預處理后的紅三葉草廢水作為溶劑定容至1 000 mL，調節pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，儲存備用。

基礎培養基:預處理后的紅三葉草預加工廢水，調節起始pH 7.0～7.2，121℃滅菌15 min，儲存備用。

發酵培養基:由預處理后的紅三葉草預加工廢水，按不同比例補加(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4和CaCl2等營養成分。

1.3 儀器

U-1800型紫外可見分光光度計，日產日立;TGL-5000B低溫冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;HHS-2數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;pH計，Thermo Orion;BS224S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司;XD電熱恒溫干燥箱，天津市實驗儀器廠;凱氏定氮儀(KDY-9810型)。

2 方法

2.1 紅三葉草鮮青草預加工廢水的處理

取紅三葉草加工廢水2 000 mL過濾，濾液于120℃加熱處理10 min，冷卻至室溫，靜置3 h，3 000 r/min離心5 min，得上清液，即可作為微生物基礎發酵培養基，或作為培養基基液補加營養成分后制備微生物發酵培養基。

2.2 菌種活化和保藏

在無菌條件下，取少量菌種干粉，于1 mL無菌水中浸泡15 min，涂平板于瓊脂培養基上，30℃下培養48 h。儲存于4℃冰箱待用，每3～6個月轉接1次。

2.3 種子液的培養

在250 mL錐形瓶中，加入100 mL種子液體培養基，接種1～2環活化的菌株，120 r/min，30℃下搖瓶培養24 h。

2.4 蘇云金芽孢桿菌的發酵培養

在1000 mL發酵培養基中，接種一定量種子液后，于120 r/min，30℃下搖床培養48 h。在每一組實驗中，發酵培養基配方和培養條件依具體實驗設計而變化。

2.5 蘇云金芽孢桿菌發酵條件的優化

采用Plackett-Burman［16］實驗篩選影響蘇云金芽孢桿菌發酵的主要因素;根據各主要因素的效應大小確定它們的變化方向及步長，設計最陡爬坡實驗，確定蘇云金芽孢桿菌發酵的最優條件所在區域的中心點;根據最優條件所在區域的中心點，設計Box-Benknken實驗，并對其結果進行響應面分析，確定蘇云金芽孢桿菌的最佳發酵培養條件。

2.6 分析檢測方法

蛋白含量的測定:采用凱氏定氮法［17］測定。

總糖含量的測定:采用蒽酮比色法［18］測定。

Bt生物量的測定:通過差量法測定干細胞的重量。取5 mL發酵液于5 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀物用蒸餾水沖洗2～3次，再離心后于105℃下烘干至恒重。以未發酵的培養基作為對照，操作方法相同。

實驗設計與數據分析:采用 Design-expert7.0(STAT-EASE inc.，Minneapolics，USA)軟件設計實驗并分析實驗數據，統計參數以標準方差來評價。

3 結果與分析

3.1 紅三葉鮮青草預加工廢水的處理

檢測結果顯示(表1):基礎發酵培養基(上清液)中，蛋白質含量為 0.437 g/L，總糖的含量為0.129 g/L，可基本滿足Bt生長所需的碳源和氮源要求。另外，該發酵培養基為紅三葉鮮青草在預加工過程中經擠壓和清洗等操作而產生的水溶液，其中還含有色素、維生素和無機鹽等成分，可作為Bt生長的營養物質。

表1 原廢水和廢水上清液的主要組成 g/L

3.2 影響蘇云金芽孢桿菌發酵主要因素的篩選

以9個因素為評價對象，每個因素取高(+1)和低(-1)2個水平，9個因素間的組合共12組實驗，Plackett-Burman(PBD)實驗設計及結果見表2。以一階模擬方程來評價9個因素的作用效果。一階回歸方程為:

表2 Plackett-Burman設計及結果

其中，Y代表預測響應值，β0和βi代表線性系數，xi代表單個因子。PBD實驗擬合的一階回歸方程為:

Y=4.39+0.80X1+0.26X2+0.19X3-0.43X4+0.37X5+0.94X6-0.33X7+1.19X8+0.047X9

其中，Y—Bt生物量(g/L);X1-(NH4)2SO4(g/L);X2-KH2PO4(g/L);X3-MgSO4(g/L);X4-CaCl2(g/L);X5-MnSO4(g/L);X6-起始pH;X7-溫度(℃);X8-發酵時間(h);X9-接種量［%(V/V)］。

在一階模擬方程中，相關系數R2為0.979 6，接近98%，因而可用此一階回歸方程來解釋響應值隨各個因素的變化。

PBD實驗結果的方差分析如表3所示。發酵時間、起始pH和(NH4)2SO4濃度對應的P值均小于0.05，因此它們是影響Bt生物量的主要因素。

表3 一階回歸方程方差分析

3.3 影響蘇云金芽孢桿菌發酵主要因素最佳值所在區域中心點的確定

在PBD實驗的基礎上，用最陡爬坡設計(SAD)來確定3個主要因素的變化方向對Bt生物量生成的影響以及它們的最佳值所在區域的中心點，SAD實驗設計和結果如表4所示。由表4可知，當發酵時間72 h、起始pH 7.0和(NH4)2SO4濃度為3.0 g/L時，Bt生物量最大(8.34 g/L)，表明此條件已接近于最優。

表4 最陡爬坡實驗設計和結果

3.4 蘇云金芽孢桿菌發酵最優條件的確定

在最陡爬坡實驗的基礎上，用Box-Behnken設計(BBD)確定3個主要因素的最優水平。每個因素設計5個水平(-1.682，-1，0，+1，+1.682)，3 個主要因素間的組合共20組實驗，實驗設計和結果如表5和表6所示。以二階模擬方程來評價3個主要因素的作用效果。二階回歸方程為:

Y= β0+∑βixi+∑βiixi2+∑βijxiyi

其中，Y代表預測響應值，xi和yi代表單個因子，β0和βi代表線性系數，βii和βij代表二階回歸系數。BBD實驗擬合的二階回歸方程為:

Y=8.42+0.13A+0.27B+0.52C－0.056AB－0.034AC+0.14BC－0.78A2－0.44B2－0.71C2

其中，Y—Bt生物量(g/L);A-發酵時間(h);B-起始pH;C-(NH4)2SO4濃度(g/L)。

在二階模擬方程中，相關系數R2為0.9572。通常，R2＞0.9000就表明實驗結果有很高的相關性，所以，此R2值反映實驗值和預測值間有很好的擬合，用該二階回歸方程描述響應值隨主要因素的變化趨勢是合理的。

表5 Box-Behnken設計因素水平表

表6 Box-Behnken設計及結果

BBD實驗結果的方差分析如表7所示。該模型對應的P值小于0.05，表明用該模型描述3個主要因素與Bt生物量間的相關性是顯著的。

表7 二階回歸方程方差分析

最后，用三維響應曲線來解釋各變量之間的相互作用并確定當響應值達到最大時各因素的最優水平，三維響應曲線如圖1～圖3所示。每個圖表示其它因素處于固定值時3個主要變量中任意2個之間的相互作用對Bt生物量生成的影響。結果表明，當發酵時間為66.71 h，起始pH為7.36和(NH4)2SO4濃度為3.08 g/L時，Bt生物量達到最大值8.57 g/L。

圖1 發酵時間和起始pH間相互作用對Bt生物量生成的響應曲線

3.5 最優條件的驗證實驗

通過上述實驗優化了利用紅三葉鮮青草預加工廢水培養Bt的最佳條件:起始pH為7.36，發酵時間為66.71 h，溫度為30℃，接種量為7.5%(v/v)，(NH4)2SO4濃度為 3.08 g/L，KH2PO41.0 g/L，Mg-SO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，MnSO40.5 g/L。為了確定該研究結果是否準確，在3 L發酵罐中于最優條件下發酵培養Bt。結果顯示，所得Bt生物量的平均值為8.57 g/L，與實驗預測值(8.42 g/L)相吻合。這表明響應模型基本準確。

圖2 發酵時間和(NH4)2SO4濃度間相互作用對Bt生物量生成的響應曲線

圖3 起始pH和(NH4)2SO4濃度間相互作用對Bt生物量生成的響應曲線

圖4 最優條件下Bt生長曲線和發酵液pH變化

圖4 為最優培養條件下Bt的生長曲線和發酵液pH值的變化情況。由圖4可知，在0～72 h時，隨著發酵時間的延長，發酵液pH逐漸增加;發酵時間超過72 h后，發酵液pH保持在8.5左右。隨著發酵時間的延長，Bt生物量逐漸增加，到72 h左右時達到最大值。

4 結論

采用響應面優化法可快速篩選以紅三葉草加工廢水為原料培養Bt時影響生物量生成的顯著因素，并通過建立多項數學模型，采用統計分析對模型進行顯著性檢驗來優化發酵條件。結果表明，最佳發酵條件為起始pH為7.36，發酵時間為66.71 h，溫度為30℃，接種量為7.5%(V/V)，(NH4)2SO4濃度3.08 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.25 g/L，CaCl20.15 g/L，MnSO40.5 g/L，在此最優條件下，Bt生物量可達到8.57 g/L，是以基礎發酵培養基產生生物量的1.2倍。因此，可利用紅三葉鮮青草預加工廢水為原料培養Bt，達到了廢物處理和合理利用資源的目的。

［1］ Figueiredo R，Rodrigues A I，do Céu Costa.Volatile composition of red clover(Trifolium pratense L.)forages in Portugal:The influence of ripening stage and ensilage［J］.Food Chemistry，2007，104(4):1 445-1 453.

［2］ 孫慶亮.紅三葉［J］.北京農業，2001，3(1):31-31.

［3］ Almora K，Pino J A，Hernández M，et al.Evaluation of volatiles from ripening papaya(Carica papaya L.，var.Maradol roja)［J］.Food Chemistry，2004，86(1):127-130.

［4］ Alves C，Pio C，Duarte A.Composition of extractable organic matter of air particles from rural and urban Portuguese areas［J］.Atmospheric Environment，2001，35(32):5 485-5 496.

［5］ Kelly，Edmund G.Methods of cholesterol reduction using isoflavones［P］.United States Patent，2004，0305782A1.

［6］ Van de Weijer P H M，Barentsen R.Isoflavones from red clover(promensil)significantly reduce menopausal hot flush symptoms compared with placebo［J］.Maturitas，2002，42(3):187-193.

［7］ 于立娜，張永忠，辛禹.紅三葉草異黃酮在保健食品和醫藥中應用的研究進展［J］.氨基酸和生物資源，2005，27(4):65-68.

［8］ Broderick G A，Albrecht K A，Owens V N，et al.Genetic variation in red clover for rumen protein degradability［J］.Animal Feed Science and Technology，2004，113(1-4):157-167.

［9］ Buttery R G，Kamm J A，Ling L C.Volatile components of red clover leaves，flowers，and seed pods:Possible insect attractants［J］.Agricultural and Food Chemistry，1984，32(2):254-256.

［10］ 魯松清，孫明，喻子牛.蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因的分類［J］.生物工程進展，1998，18(5):57-59.

［11］ 史麗，白海艷，王瑞君，等.蘇云金桿菌在溫室蔬菜害蟲防治中的應用［J］.內蒙古師范大學學報:自然科學版，2003，32(2):153-156.

［12］ Gill S S，Cowles E A，Pietrantonio P V，et al.The mode of Bacillus thuringiensis endotoxins［J］.Annu Rev Entomol，1992，37:615-634.

［13］ 孫明，喻子牛.蘇云金芽孢桿菌中華亞種CT-43菌株伴胞晶體蛋白的特性［J］.微生物學報，1996，36(4):303-306.

［14］ 關雄.蘇云金芽胞桿菌研究回顧與展望［J］.中國農業科技導報，2006，8(6):5-11.

［15］ Estruch J J，Warren G W，Mullins M A，et al.Vip3A，a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidoteran insects［J］.Pro Natl Acad Sci USA，1996，93(11):5 389-5 394.

［16］ Wang J C，Wu C F J.A hidden projection property of plackett-burman and related designs［J］.Statistica Sinica，1995(5):235-250.

［17］ 戴宏林，吳小駿.用凱氏定氮法測定植物干樣中的氮含量［J］.江蘇農學院學報，1995，16(3):70-70.

［18］ 文赤夫，董愛文，李國章，等.蒽酮比色法測定紫花地丁中總糖及還原糖含量［J］.現代食品科技，2005，21(3):122-123.