姜蓉中分離棲冷克呂沃爾菌生理生化特性及還原硝酸鹽的研究

陳血建，蘭全學，嚴瓊英，楊俊，陳晶，葉秀玲，楊國武

(深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳，518131)

蔬菜是人們日常飲食中必不可少的，它為人體提供必需的多種維生素、礦物質和纖維素，同時，蔬菜也容易富集硝酸鹽。據報道，人體攝入的硝酸鹽有81.2%來自蔬菜［1］，蔬菜經不正確的放置和處理后，其中的硝酸鹽會在微生物的作用下被還原成亞硝酸鹽［2］，亞硝酸鹽通過與血紅蛋白反應導致人體缺氧、與次級胺結合則可誘發癌癥。據報道，自然界能還原硝酸鹽的細菌有百余種［3］，了解這些細菌的特性，對于我們正確存放和處理蔬菜，減少亞硝酸鹽的攝入具有指導意義。

筆者在對餐飲企業食品的亞硝酸鹽項目監測中，分離得到1株棲冷克呂沃爾菌，本文對該菌的生理生化特性以及該菌在還原硝酸鹽及在姜蓉亞硝酸鹽產生中發揮的作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棲冷克呂沃爾菌，從深圳市某餐飲企業提供的一份沙拉原料即用嫩姜姜蓉(亞硝酸鹽含量160 mg/kg，以N計)中分離得到。

血瓊脂平板，鄭州安圖綠科生物工程有限公司;營養肉湯、平板計數瓊脂(PCA)，北京陸橋技術有限責任公司;硝酸鹽和亞硝酸鹽快速測定試劑條(反應墊上為固體格利斯試劑對氨基苯磺酰胺和N-1萘基乙二胺)，美國Industrial Test Systems公司;Vitek2 GN鑒定卡，法國生物梅里埃公司。

VITEK2 Compact全自動微生物鑒定儀，法國生物梅里埃公司;SHP-250生化培養箱，中國上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 棲冷克呂沃爾菌的來源

以1份亞硝酸鹽含量為160 mg/kg(以N計)的仔姜姜蓉為材料，涂布血瓊脂平板和PCA平板，在37℃下分別置于需氧、微需氧、厭氧條件培養3～6 d，從兩種平板中挑取菌落形態占優勢的菌株進行純化培養和生化鑒定，獲得棲冷克呂沃爾菌。

1.2.2 棲冷克呂沃爾菌的生理生化特性分析

對棲冷克呂沃爾菌革蘭氏染色，并用全自動微生物鑒定儀VITEK 2 Compact進行生化鑒定。同時，將該菌株接種于硝酸鹽肉湯生化管中，37℃培養24 h，加入硝酸鹽還原甲、乙液，觀察顏色變化，檢測該菌能否還原硝酸鹽。

1.2.3 棲冷克呂沃爾菌在不同冷藏溫度的生長特性

將濃度分別為102、104、106CFU/mL的棲冷克呂沃爾菌營養肉湯(pH 7.0、NaCl濃度為0.5%)分別置于1℃、4℃、8℃條件下培養，每日采用傾注平板法測定菌懸液細菌濃度。

1.2.4 棲冷克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長特性

配制NaCl濃度為0.5%、1%、2%、5%的營養肉湯(pH 7.0)，分別加入棲冷克呂沃爾菌，使菌懸液濃度為102CFU/mL，置于8℃培養，每日采用傾注平板法測定菌懸液細菌濃度。

1.2.5 棲冷克呂沃爾菌在不同pH值的生長特性

配制 pH 4.0、5.0、6.0、7.0 的營養肉湯(NaCl濃度為0.5%)，分別加入棲冷克呂沃爾菌，使菌懸液濃度為102CFU/mL，置于8℃培養，每日采用傾注平板法測定菌懸液細菌濃度。

1.2.6 棲冷克呂沃爾菌模擬污染試驗

將8個不同產地的仔姜品種機械粉碎制成姜蓉，100℃蒸汽處理30 min，污染棲冷克呂沃爾菌，使姜蓉的細菌濃度數量級為105CFU/g，置于8℃培養，每日監測姜蓉中亞硝酸鹽含量和細菌濃度。各品種均設置不加細菌的空白對照。

2 結果與分析

2.1 棲冷克呂沃爾菌的生理生化特性

棲冷克呂沃爾菌在血瓊脂平板和PCA平板上均形成圓形、光滑、濕潤的白色菌落，菌落直徑約1～2 mm，無溶血現象。革蘭氏染色呈陰性桿菌，多單個散在，無芽孢，菌體大小為(0.5～0.7)μm×(2～3)μm。全自動微生物鑒定儀VITEK 2 Compact生化鑒定結果見表1。該菌為兼性厭氧菌，可使硝酸鹽肉湯顏色變為紅色，能還原硝酸鹽。

表1 棲冷克呂沃爾菌生化鑒定結果

2.2 棲冷克呂沃爾菌在不同冷藏溫度的生長特性

由圖1～圖 3可見，初始濃度為 102、104、106CFU/mL的棲冷克呂沃爾菌營養肉湯，在1℃培養時，未見明顯生長，12d內細菌濃度變化甚小;在4℃培養時，102、104CFU/mL濃度的棲冷克呂沃爾菌開始出現緩慢生長現象，達到107CFU/mL濃度所需要的時間分別為22d、11d;106CFU/mL濃度的棲冷克呂沃爾菌生長迅速，達到107CFU/mL濃度所需要的時間為2d;在8℃培養時，3種初始濃度的棲冷克呂沃爾菌達到108CFU/mL濃度僅需要7 d、4 d、2 d。

2.3 棲冷克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長特性

圖1 棲冷克呂沃爾菌生長試驗結果(1℃)

由圖4可見，當NaCl濃度為0.5%、1%、2%時，棲冷克呂沃爾菌緩慢生長，在培養7～9d后濃度可升高至107CFU/mL，最高可達到108CFU/mL;當NaCl濃度為5%時，該菌會逐漸死亡，在培養4d后全部死亡。

圖2 棲冷克呂沃爾菌生長試驗結果(4℃)

圖3 棲冷克呂沃爾菌生長試驗結果(8℃)

圖4 棲冷克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長試驗結果(8℃)

2.4 棲冷克呂沃爾菌在不同pH值的生長特性

由圖5可見，在pH4.0條件下，棲冷克呂沃爾菌呈逐漸死亡趨勢，在培養13d后全部死亡;在pH5.0、6.0、7.0條件下，菌株緩慢生長，在培養的第5～6d菌液濃度可達到107CFU/mL。

圖5 棲冷克呂沃爾菌在不同pH環境下的生長試驗結果(8℃)

2.5 棲冷克呂沃爾菌模擬污染試驗

由表2、表3可見，8個品種姜蓉在污染棲冷克呂沃爾菌后，3個品種姜蓉在第4天開始檢出亞硝酸鹽，4個品種姜蓉在第5天開始檢出亞硝酸鹽，廣東大姜檢出亞硝酸鹽的時間相對較遲，在第8天才檢出;其中紅芽姜的亞硝酸鹽含量在第7天高達160 mg/kg(以N計)。各品種姜蓉所達到的亞硝酸鹽峰值與其本身的硝酸鹽含量不成正相關。

測定亞硝酸鹽含量的同時監測8個品種姜蓉中棲冷克呂沃爾菌的菌落數量變化。由表2、表4可見，多數姜蓉在細菌濃度達到107CFU/g時開始檢出亞硝酸鹽，在細菌濃度達到108CFU/g時，亞硝酸鹽含量達到峰值。8個未加細菌的對照姜蓉在12 d內均未檢出亞硝酸鹽。

表2 不同姜蓉的亞硝酸鹽濃度隨時間變化結果(8℃)

表3 不同姜蓉初始硝酸鹽含量和亞硝鹽峰值

3 結論與討論

本文分析了從1份亞硝酸鹽含量較高的姜蓉中分離的1株棲冷克呂沃爾菌。克呂沃爾菌是1981年獨立成屬的腸桿菌科細菌，存在于食物、土壤和污水中［4-5］。目前，國內外只有極少量的關于克呂沃爾菌引起臨床感染病例的報道，未見到棲冷克呂沃爾菌引起蔬菜中亞硝酸鹽大量積聚的報道［4-8］。本文研究表明，該菌能還原硝酸鹽，在4～8℃可大量生長繁殖，適宜生長的 NaCl濃度為0.5% ～2%，pH值為5.0～7.0，模擬污染試驗證實，該菌可以把姜蓉中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。污染了棲冷克呂沃爾菌的各品種姜蓉，最初亞硝酸鹽含量極低，經過一段時間后緩慢上升，隨菌株的大量繁殖而迅速達到峰值，然后呈現緩慢下降趨勢，這一現象與其他文獻報道相似［1，8-11］。

我國食品衛生法規標準GB2762規定，蔬菜中亞硝酸鹽限量指標為≤4 mg/kg［13］。本文研究結果提示，通過控制冷藏溫度、食鹽濃度及pH值可有效防止棲冷克呂沃爾菌在蔬菜中生長繁殖，避免由該菌大量繁殖引起亞硝酸鹽大量積累。

有文獻指出，姜中含有線性和環狀的二苯基庚烷類化合物，該類化合物具有抗氧化性，能抑制氧分子自由基的生成，從而對亞硝酸鹽的產生有一定程度的阻斷作用［13-14］。本研究中，污染棲冷克呂沃爾菌的各品種姜蓉所達到的亞硝酸鹽峰值，與其初始硝酸鹽含量不成正相關，結果提示姜蓉在模擬污染試驗中產生的亞硝酸鹽主要與棲冷克呂沃爾菌的大量繁殖有關，還可能與姜蓉中二苯基庚烷類化合物等其他因素有關。

表4 不同姜蓉中細菌濃度隨時間變化結果(8℃)

［1］ 李紅，任乃林.蔬菜放置中亞硝酸鹽的變化［J］.食品研究與開發，2010，33(3):205-207.

［2］ 徐貴華，張遠，白清元，等.食前處理及存放時間對蔬菜亞硝酸鹽含量的影響［J］.河南科技學院學報，2011，39(4):28-31.

［3］ 張慶芳，遲乃玉，鄭艷，等.關于蔬菜腌漬發酵亞硝酸鹽問題的探討［J］.微生物學雜志，2003，23(4):41-44.

［4］ 侯天文，李瑋，陳興，等.自膽汁中檢出棲冷克呂沃爾菌一例［J］. 華北國防醫藥，2006，18(3):218.

［5］ 明德松.棲冷克呂沃爾菌耐藥性及β-內酰胺酶檢測［J］. 中華醫院感染學雜志，2007，17(3):342-343.

［6］ 李紅梅，顏允中.從一患者膽汁與肝內膿液及傷口分泌物中同時分離出克呂沃爾菌［J］.臨床檢驗雜志，1995，13(2):110.

［7］ FarmerⅢ J J，Fanning G R，Huntley G P，et al.Kluyvera，a new(Redefined)genus in the family enterobacteriaceae:identification of Kluyvera ascorbata sp.nov.and Kluyvera cryocrescens sp.nov.in clinical specimens［J］.Journal of Clinical Microbiology，1981，13(5):919-933.

［8］ 吳寒靜，寧玉華，顏秉興.從膽汁中檢出抗壞血酸克呂沃菌［J］. 上海醫學檢驗雜志，1999，14(1):51.

［9］ 李美茹，張光民，康素月.不同處理條件對蔬菜亞硝酸鹽含量的影響［J］.北方園藝，2008(7):20-23.

［10］ 吳海波，張蘭威，黃艷玲.不同地域發酵蔬菜分離的乳酸菌抑菌效果及降亞硝酸酸鹽能力的研究［J］.食品工業科技，2009，30(2):80-83.

［11］ 張慶樂，王浩，李瑞，等.食前處理方式對蔬菜中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的影響［J］.中國食品衛生雜志，2008，20(3):267-269.

［12］ GB2726-2005.食品中污染物限量［S］.

［13］ 權美平，惠亮亮.泡菜中亞硝酸鹽的研究進展［J］.農產品加工學刊，2012，283(6):92-93.

［14］ 汪勤，高祖民，徐穎潔.姜汁與維生素C阻斷腌漬蔬菜產生亞硝酸鹽的研究［J］.南京農業大學學報，1991，14(4):99-103.