超高壓促進β-環糊精向大米顆粒內部的有效滲入*

劉莉，趙建偉，焦愛權，田耀旗，周星，徐學明，金征宇

1(江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

2(江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

隨著經濟的發展、生活節奏的加快，方便食品越來越受到人們的青睞［1］。方便米飯是一種新興食品，不僅滿足即食方便的要求，而且作為一種主食產品，彌補其他方便食品營養單一的不足。方便米飯營養豐富符合現代人的消費理念，具有廣闊的發展前景，但其在存儲過程中硬度增加，黏度降低，從而使口感變差和消化性降低。因此抑制回生是改善方便米飯品質，延長貨架期的首要因素。

回生問題可通過采取各種有效措施來延緩，但不能完全抑制。相關文獻報道［2-6］多集中于物理抗性修飾，即添加抗淀粉回生的食品添加劑，如低聚糖、親水性膠體和乳化劑等。低聚糖β-環糊精(β-CD)分子尺寸小，易溶于水，在淀粉糊化過程中，可隨著水分滲透進入淀粉顆粒的內部，與淀粉分子相互作用。在淀粉短期回生過程中，β-CD外壁親水性羥基與直鏈淀粉α-單螺旋外層羥基以氫鍵作用力結合形成絡合物，抑制游離的直鏈淀粉快速滲透于支鏈淀粉結晶區而有序重排，起到回生延緩作用［3］。在通常蒸煮條件下，抑制回生的添加劑難以滲透到大米顆粒內部，滲透效果程度較低，抗回生效果并不理想。

熒光示蹤法是添加便于追蹤的色素或熒光物質來觀察、研究和闡明某物質在指定過程中的行為或性質的一種標記方法。熒光示蹤技術的關鍵是制備熒光標記聚合物。通過采用電腦多媒體技術配合熒光顯微鏡，建立了熒光示蹤系統，對樣本進行連續逐層掃描，得到細胞或組織內部細微結構的熒光圖像［7-8］。

本文采用在大米浸泡液中添加β-CD，并用超高壓處理以期減少米飯回生程度。本文用高效液相色譜法(HPLC)定量檢測大米浸泡液中β-CD的殘留量和用示蹤法來跟蹤β-CD滲入溫水浸泡米粒中的分布情況。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

粳米(福臨門響水香米)，市購，水分含量為15.31%(w.b.)，購回后儲藏在4℃的冰箱中。

β-CD，上海西寶生物科技有限公司;β-CD標樣，Sigma-Aldrich公司;葡萄糖淀粉酶，無錫杰能科生物有效公司;豬胰 α-淀粉酶，sigma公司;1，8-二羥基蒽醌，上海晶純試劑有限公司;OCT(opti-mum cutting temperature)包埋劑，上海西塘生物公司;其他所有試劑均為分析純。

蒸汽蒸煮器，由小型滅菌鍋改造;立式蒸煮袋，市購;超高壓設備(HP800Mpa/3L)，包頭科發高壓科技有限公司;高效液相色譜儀(Water 600)，美國water公司;NH2柱，美國Thermo公司;紅外光譜儀(NICOLET NEXUS 470)，美國Thermo公司;激光共聚焦顯微鏡(LSM 710)，德國Lavision Biotec;柜式冰凍切片機(Micron HM560)，上海倍曼生物有限公司。

1.2 方法

本研究在米粒浸泡液中添加β-CD/包合物，并用不同壓強處理浸泡液。一方面因大米顆粒成分復雜，直接測定滲入的β-CD不易，故采用間接的方法用HPLC測定米粒浸泡液中β-CD含量;另一方面選擇適宜的熒光分子與 β-CD包埋來示蹤 β-CD在500MPa下向大米顆粒內部的滲入分布情況。本實驗方法流程圖如圖1:

圖1 實驗方法流程圖

1.2.1 制備殘留β-CD的大米浸泡液

實驗目的是制備在常壓和超高壓壓強下添加2%的β-CD的大米懸浮液中含殘留β-CD的浸泡液。將1 g β-CD溶于75 mL超純水，加大米50 g，到立式鋁箔食品袋后真空封裝。然后在常壓60℃的浸泡30 min，然后四組樣品分別在0，100，300和500 MPa(溫度為40℃)下浸泡20 min，收集各組的浸泡液。

將4組的浸泡液分別倒入標有記號的錐形瓶中，然后4次用50 mL的超純水沖洗米粒表面上殘留的浸泡液一并收集到對應的錐形瓶中。在浸泡液中加入1 000 u/mL的葡萄糖淀粉化酶3 μL，在37℃的恒溫振蕩水槽中振蕩3 h。隨后，各組浸泡液定容到350 mL，在100℃下電磁攪拌10 min，5 000 r/min離心15min，收集各組浸泡液的上清液，進行高效液相色譜(HPLC)定量檢測樣品中β-CD的含量。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定β-CD的含量

液相是Waters 600，使用氨基柱，示差折光檢測器，流動相是 V(乙腈)∶V(水)=70∶30，柱溫 30℃，流速 1 mL/min，進樣量 10 μL。

取大米浸泡的上清液10 mL樣品經微孔過濾器過濾(孔徑0.45 μm)，進 HPLC分離，得到流出峰。依據標樣的峰面積計算大米浸泡液中β-CD含量。

β-環糊精標準樣品配制:精密稱量β-環糊精標樣10.00 mg，置10.0 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mg/mL濃度的溶液，作為標準液。

1.2.3 固體包合物的制備和表征

將充分干燥的約4 g的β-CD溶于約70～80℃的500 mL熱水中，待β-CD全部溶解后加入約0.8 g的1，8-二羥基蒽醌，于50℃下攪拌12 h，逐步降溫，待析出黃色晶體后減壓過濾，用溫水洗滌干燥，所得產物為 β-CD 與 1，8-二羥基蒽醌的包合物［7-8］。在相同條件下分別做1，8-二羥基蒽醌、β-CD、β-CD 與1，8-二羥基蒽醌混合物、β-CD 與 1，8-二羥基蒽醌包合物的紅外光譜。制樣方法:KBr壓片法;掃描次數32次分辨率4 cm-1。同時做2% β-CD與1，8-二羥基蒽醌包合物溶液的差示掃描量熱譜，溫度掃描20-100℃，升溫速率5℃/min。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡掃描觀察

將5 g大米于立式鋁箔小蒸煮袋中，在7.5 mL大米浸泡液中添加2%的包合物，在60℃的溫水中浸泡30 min。超高壓樣品在500 MPa，40℃的超高壓條件下浸泡20 min。因米粒冰凍切片易破碎保持不完整性，所以將米飯繼續進行蒸煮軟化。米粒放在立式蒸熟袋中封裝，在沸水浴中蒸煮7 min，燜飯10 min，冷卻至室溫。將常壓處理和超高壓處理的米飯進行OCT包埋后放置在-18℃冷凍約3 h。在-30℃下冰凍切片，切片厚度為30 μm。各組樣品在相同的條件下用激光共聚焦掃描觀察。

激光共聚焦掃描條件為掃描模式:平行;物鏡:Zeiss EC Plan Neofluar 20X/0.50 M27;分光鏡:MBS488/543(MBS_InVis:plate FW1:NonelLSW);激光:543 nm;像素停留時間:2.33 μs;濾光器:554～697;X 軸縮放:1.661 μm;Y 軸縮放:1.661 μm。對切片小區域逐一掃描，然后自動拼成米飯切片完整的熒光圖像。

2 結果與討論

2.1 高效液相法(HPLC)測定米粒浸泡液中的β-CD含量

在設定的分析條件下，對1 mg/mL的β-CD的標樣和分別在0、100、300和500 MPa(溫度40℃，時間20 min)的米粒浸泡液進行分離定量測定。試驗結果如圖2所示，β-CD在保留時間11.00 min處開始出峰，β-CD的含量在常壓對照組中最高，不同壓強條件下β-CD的含量存在顯著性差異。可以看到，隨著處理壓強的增大，浸泡液中殘留的β-CD含量減少，則進入米粒中的β-CD逐漸增多。在所有樣品的浸泡液中都添加了2%的β-CD即1.0 g，常壓對照組浸泡液在常壓下殘留量為0.86 g，說明用4次超純水沖洗浸泡米粒后，米粒表面吸附有少量的β-CD或進入米粒顆粒。在500 MPa處理下，浸泡液中的β-CD含量顯著減少，僅為0.424 g。較之常壓對照組，在500 MPa下浸泡處理的米粒多滲入了約0.436g β-CD。滲入米粒的β-CD的含量隨超高壓壓強增加而增多。通過HPLC法定量測定不同壓強下浸泡液中的β-CD的分析結果可看出，β-CD在超高壓條件下可以滲入60℃溫水預浸泡的米粒內部。

圖2 β-環糊精標準品和不同壓強下處理大米浸泡液的高效液相色譜圖

表1 常壓下和不同壓強下浸泡液中殘留的β-環糊精含量

2.2 包合物鑒定和表征

圖3 β-CD和1，8-二羥基蒽醌的紅外吸收光譜圖

比較圖3中各紅外吸收圖譜發現，β-CD和1，8-二羥基蒽醌的的紅外吸收圖譜有明顯差別。在1 600 cm-1附近的苯環骨架振動和1670 cm-1附近的C=O伸縮振動可以明顯地看到1，8-二羥基蒽醌的特征峰。對照于β-CD，包合物圖譜中臨近C=O的CH3在1 370 cm-1有中等強度的吸收峰(對稱彎曲振動)，說明有新物質的介入使其出現新峰。包合物較之于物理混合物，1，8-二羥基蒽醌的許多吸收峰被掩蓋，并且在1 670 cm-1附近的C=O伸縮振動的吸收峰有所增強，說明有新物質產生，可能是因為β-CD包合1，8-二羥基蒽醌，使1，8-二羥基蒽醌的構象發生變化。

2.3 包合物溶液熱學性質

從圖4可看出β-CD-1，8-二羥基蒽醌包合物曲線出現一個吸熱峰，在66.87℃ -80℃處為包合物的分解吸熱帶。在水分子競爭作用下，隨著溫度的增大，β-CD與1，8-二羥基蒽醌間的氫鍵作用力越來越弱，而與水分子間的作用力越來越強。包合物從66.87℃開始慢慢解體，最后在80℃處分解大致完成。1，8-二羥基蒽醌不溶于水，包合物易溶于水，且熒光強度增加［8］。包合物添加到浸泡液中，在低于66.87℃下，溫水浸泡和超高壓浸泡處理中包合物都不容易發生分解。在蒸汽蒸煮過程中，即使包合物發生可逆反應釋放1，8-二羥基蒽醌，由于不溶于水不易進入米粒而對實驗造成干擾。米飯內部已進入的包合物部分發生分解釋放出1，8-二羥基蒽醌，同樣也具有熒光性，對米飯切片顯微鏡觀察亦不造成影響。所以從DSC圖，可以看β-CD-1，8-二羥基蒽醌包合物可以作為超高壓處理過程中β-CD滲入的示蹤劑，用來示蹤β-CD在超高壓處理中的滲入分布情況。

圖4 2%β-CD與1，8-二羥基蒽醌的包合物溶液的差示掃描量熱圖

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察

圖5 為在常壓和超高壓不同浸泡條件下的米飯橫截面切片掃描圖。

圖5 A，B為常壓處理的米飯切片C，D和E為超高壓500 MPa浸泡處理的米飯切片(白色箭頭所示為米飯內部的縫隙)

從圖5中可以看出，米飯切片的內部有若干條黑色的細長條，推測為米飯顆粒內的縫隙。在切片過程中冰凍刀片切割力的作用使得米粒內縫隙有進一步增大的可能。米飯切片的邊緣若干處有強熒光性，說明米飯在熒光包合物溶液中浸泡殘留了一些熒光物質在米飯表面。從圖5觀察到，從米飯切片的外圍部分到中心處，熒光強度并非由強依次減弱。這說明包合物在超高壓處理下進入到米粒內部的滲透不局限于通過擴散運動而停滯在米粒表面外部。為了進一步探討米粒間的縫隙是否存在，即考察包合物進入米飯的途徑，用豬胰α-淀粉酶溶液來水解米飯。實驗發現淀粉酶并不是一圈一圈地水解米飯，米飯表層各部分水解程度不一樣，凹凸不平，甚至有些米飯被水解地支離破碎(圖6)。說明米粒內的縫隙是存在的，縫隙是從米粒表面通向米粒內部，淀粉酶正是通過這些裂縫滲透，不斷地水解大米淀粉分子。

谷物中淀粉顆粒的形態結構、谷物顆粒間的裂紋分布和硬度分布決定了水滲透的路徑和速度。Horigane［9］等通過三維加權梯度回波磁共振成像技術監測米粒浸泡過程中水分的滲透路徑。研究日本普遍食用的Koshihikari米粒浸泡時，水分子首先穿透米粒的腹側表面和胚芽附著位點，然后沿著胚乳中央線和橫向裂紋遷移，最終擴散到胚乳的其它部分。帶白點的Yamadanishiki大米在浸泡時，除了在最開始時水分快速滲透進裂縫處或背腹邊的白堊部分，水滲透的位點和水分擴散模型跟前者是相似的。因此無論是普通米粒還是帶白點有胚芽的米粒，米粒內部的裂縫處和中央部分存在一個非常松散的結構、空腔或裂紋，可以允許更多的水滲透保留。水分滲透主要是通過米粒表面到內部的縫隙、胚乳部分的中央線和橫向裂紋擴散到米粒胚乳其他部分。

圖6 淀粉酶水解米飯前后對照圖

超高壓處理的米飯切片中間部分的熒光強度明顯高于常壓處理米飯，且熒光物質多集中于米粒切片內部縫隙的淀粉大顆粒附近。實驗表明超高壓處理大大加強了包合物向米粒內部的滲透作用。Ahrmrit等［10］通過大量實驗統計發現超高壓處理可促進浸泡大米的水分滲透，并且水分滲入量與超高壓壓強、溫度和時間條件成正相關。同時超高壓進一步破壞米粒的硬質纖維［11］，有利于包合物充分進入米粒內部。β-CD包合物分子尺寸小，易溶于水，在超高壓外力強制滲透浸泡及淀粉糊化過程中，可隨著水分滲透沿著米粒表面處的裂紋、胚乳中央線和橫向裂紋遷移，最終擴散到胚乳的所有部分。隨著淀粉糊化進行，淀粉顆粒內結晶區域則由原來排列緊密有序的狀態變為疏松雜亂狀態，包合物與淀粉分子相互作用。從以上的分析可知，β-CD可通過超高壓處理充分滲透到米粒內部，從而使得有效抑制大米淀粉的回生成為可能。

3 結論

(1)通過HPLC液相法定量檢測常壓和不同超高壓壓強處理下米粒浸泡液中殘留β-CD含量，實驗結果表明隨著壓強的增大，浸泡液中β-CD的殘留量減少，從而說明β-CD超高壓浸泡處理能有效促進β-CD到米粒內部。

(2)β-CD來包埋1，8-二羥基蒽醌制備成的包合物具有強熒光性，可示蹤β-CD在超高壓條件下的滲入情況，對照常壓浸泡的米飯切片可看出，超高壓浸泡米飯切片內部熒光強度強于未處理米粒，說明超高壓處理確實能有效滲透β-CD米飯內部。

(3)超高壓浸泡米飯切片的熒光物質主要集中在米飯中間部分的縫隙處，在米飯內部分布較為均勻，具有強熒光性。

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