樹鼩CD4全長編碼序列的克隆及分子特征分析

田巍威, 高躍東, 郭 彥, 黃京飛, 肖 昌, 李作生, 張華堂,*

(1. 西南大學 生物技術學院, 重慶 北碚 400715; 2. 云南沃森生物技術股份有限公司, 云南 昆明 650106; 3. 中國科學院昆明動物研究所動物模型與人類疾病機理重點實驗室; 免疫生物學實驗室, 云南 昆明 650223; 4. 中國科學院昆明生物多樣性大型儀器區域中心,云南 昆明 650223; 5. 中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室, 云南 昆明 650223)

樹鼩CD4全長編碼序列的克隆及分子特征分析

田巍威1,2,3, 高躍東4,5, 郭 彥3, 黃京飛4,5, 肖 昌1, 李作生2,*, 張華堂3,*

(1.西南大學 生物技術學院,重慶 北碚400715; 2.云南沃森生物技術股份有限公司,云南 昆明650106; 3.中國科學院昆明動物研究所動物模型與人類疾病機理重點實驗室;免疫生物學實驗室,云南 昆明650223; 4.中國科學院昆明生物多樣性大型儀器區域中心,云南 昆明650223; 5.中國科學院昆明動物研究所 遺傳資源與進化國家重點實驗室,云南 昆明650223)

樹鼩作為多種人類疾病研究模型的可能性已受到廣泛關注, 但尚缺乏研究其免疫功能的基本標志以及單克隆抗體。該實驗首先以樹鼩外周血總RNA為材料, 通過RT-PCR擴增得到長度為1 365 bp的樹鼩CD4全長編碼序列, 并確定了數據庫中缺失的兩個片段, 進而通過Clustal W等軟件對其序列和分子特征進行分析, 發現樹鼩CD4氨基酸序列胞外和胞內域保守性較好，且與人類和猴的親緣關系較近。雖然樹鼩和人CD4分子表面大部分區域均帶正電荷, 但與人CD4胞外域D1相比, 樹鼩CD4 D1結構區域表面帶負電荷較多, 且多出兩個N-糖基化位點。這些差異對抗體的結合可能存在影響。該研究為今后樹鼩CD4單克隆抗體制備及功能研究奠定了基礎。

樹鼩; CD4分子; RT-PCR; 結構; 功能; 單克隆抗體

CD4是具有4個Ig樣結構域的單鏈跨膜糖蛋白,主要表達于T淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞, 參與T細胞的活化(Zeitlmann et al, 2001)。作為T輔助細胞(T-helper)活化的協同受體(co-receptor), 其胞外域可以與MHC-II (major histocompatibility complex class II)結合, 穩定TCR與抗原肽-MHC- II復合物之間的相互作用(Grakoui et al, 1999)；而其胞內域中的保守基序KKTCQC能與酪氨酸蛋白激酶Src家族成員p56lck結合, 參與T細胞活化的信號轉導過程(Glaichenhaus et al, 1991)。

樹鼩(tree shrews,Tupaia belangeri)是一類外型酷似松鼠的小型哺乳動物, 主要分布于我國西南部、菲律賓、印度等地(Cao et al, 2003)。早在1987年, Su et al (1987)發現成年樹鼩接種人HBV感染血清后, 其血清中能夠檢測到乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)。Walter et al (1996)報道新生樹鼩經人HBV感染后, 表現出類似人類的急性自限性肝炎。此外, 已有報道樹鼩對HCV、HSV亦具有易感性(Zhao et al, 2002; Darai et al, 1980)。由于樹鼩對多種人類病毒易感且個體小、易于飼養, 其作為多種人類疾病研究模型的可能性已受到廣泛關注。

目前, 針對樹鼩CD4的研究較少, 僅有根據樹鼩2倍覆蓋率基因組結合參考人類CD4 (HGNC ID:1678)預測所得序列, 且存在兩處未知片段, 影響了單克隆抗體制備中CD4抗原表位分析。為此,本研究首先以獲得樹鼩CD4完整編碼序列為目的,同時比較分析其分子特征, 為樹鼩CD4單克隆抗體的制備和功能研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 動物

本研究采用的滇緬樹鼩購于云南省昆明醫學院實驗動物中心。

1.2 樹鼩CD4全長編碼序列克隆

根據已有預測樹鼩CD4序列(http://asia. ensembl.org/index.html, ENSTBEG00000000662),上游引物設計為:5'-ATGGACCGCCCAGTCCGG-3', 由于上述序列3'端尚不完整, 因此參考人、狨毛猴等物種的CD4序列, 下游引物設計為: 5'-TCACATGAGACTACATGTCTTCTGAAACC-3'(圖1)。

圖1 樹鼩CD4已知序列和殘缺序列以及引物設計Fig.1 Primers for PCR amplification of tree shrews CD4 cDNA

采集樹鼩外周血, 提取血液總RNA (試劑盒購于BioTeKe), 將其反轉錄為cDNA。利用上述引物進行PCR, 循環參數為：94 ℃, 3 min; 94 ℃ 30 s, 45 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 32個循環; 72 ℃, 10 min (RT-PCR試劑盒購于TIANGEN)。用樹鼩管家基因GAPDH(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase)作為陽性對照。PCR產物經TA克隆插入pMD-19T載體后, 轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞, 提取質粒進行雙酶切鑒定, 最終進行雙向測序(北京三博志遠基因技術有限公司)。

1.3 分子特征分析

本文用以參比的核酸序列均來源于GenBank,以DNAMAN6.0、BlastP、Clustal W2.0、MEGA4、Discovery Studio和PyMOL分別進行核酸序列、氨基酸序列、物種親緣關系分析及蛋白質三維結構模建。而信號肽和跨膜域結構分析則采用在線預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/; http://www. ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)。

2 結果與討論

2.1 樹鼩CD4全長編碼序列擴增與比較分析

利用樹鼩外周血總RNA, 通過RT-PCR獲得長度約為1 365 bp的核酸片段(圖2)。通過雙向測序,我們確定了所得序列為樹鼩CD4分子全長編碼序列, 開放閱讀框長度為1 365 bp, 編碼454個氨基酸（GenBank登陸號為JN657224）。通過DNAMAN 6.0進行多序列比對，所獲得樹鼩CD4編碼序列確定了原預測序列(ENSTBEG00000000662)中第611～797、1 019～1 357的殘缺片段, 共計526 bp (圖3)。同時, 我們發現已測序列與原預測序列存在差異(表1)。此外, 原預測序列中第798～803、1 358～1 360位9個堿基, 未在我們實測序列中未檢出, 而我們實測序列第901～903位的3個堿基在原預測序列中未檢出, 但上述差異并未導致移碼突變。本實驗采用高保真Pfu酶擴增基因并進行兩次雙向測序, 有效地排除了實驗誤差。因此, 我們所獲得的樹鼩CD4分子全長編碼序列是較為準確的。

圖2 樹鼩CD4 cDNA擴增Fig.2 RT-PCR amplification of tree shrews CD4 cDNA

圖3 樹鼩CD4預測序列未知片段及對應氨基酸Fig.3 The two unknown fragments of the predicted tree shrews CD4 cDNA and the corresponding amino acid

表1 樹鼩CD4 cDNA預測序列與實測序列差異性比較Tab. 1 Comparison of the predicted tree shrews CD4 cDNA sequence and the obtained sequence

氨基酸差異

Amino acid differencesSer→ProArg→Trp Ile→Val Gly→Ser Asn→Ser Ser→Thr Thr→Ala Gln→Arg Val→Gly Ser→Thr Thr→Leu Arg→Gly

2.2 樹鼩CD4氨基酸序列分析

2.2.1 樹鼩CD4整體結構與親緣關系分析

圖4 樹鼩CD4推導氨基酸序列比對分析Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of tree shrews CD4 with those from other mammals

樹鼩CD4分子由454個氨基酸組成, 屬于Ⅰ型跨膜蛋白。信號肽和跨膜域在線預測顯示, 樹鼩CD4整體結構與人CD4相似, 可分為信號肽(1～25)、胞外域(26～392)、跨膜域(393～416)、胞內域(416～454)四部分(圖4), 我們采用Blast P及Clustal W2.0對推導得到的樹鼩CD4(JN_657224)氨基酸序列與人(NM_000616)、恒河猴(NM_001042662)、狼犬(NM_001003252)、穴兔(NM_001082313)、綿羊(NM_001129902)、大鼠(NM_013488)、小鼠(NM_012705)等哺乳動物進行比較(圖4), 發現樹鼩CD4氨基酸序列與人類、恒河猴的相似度較高, 分別為61%、60%, 而與大鼠、小鼠的相似度較低, 分別為48%、46%。同時, 我們利用MEGA4對樹鼩CD4親緣關系進行分析, 結果顯示, 樹鼩與人類、恒河猴聚集, 而與大鼠、小鼠距離較遠, 說明樹鼩在進化關系上跟人類和恒河猴更接近(圖5)。

圖5 樹鼩和其他哺乳動物CD4之間的親緣關系Fig.5 Phylogentic relationships between CD4 chains from tree shrews and other mammals

2.2.2 樹鼩CD4胞外域特征

人CD4胞外域主要由4個免疫球蛋白樣結構D1、D2、D3、D4組成, 胞外域中存在3對二硫鍵。它們分別是形成于D1結構的Cys41和Cys109；D2結構的Cys155和Cys184；D4結構的Cys328和Cys370(Matthias et al, 2002)。通過Discovery Studio,我們對人和樹鼩的CD4胞外域進行了三維空間結構分析。結果顯示, 樹鼩CD4胞外域和人CD4胞外域整體相似, 都可分為四個免疫球蛋白樣結構,在樹鼩的D1和D4結構域中能找到相應的二硫鍵,但形成D2中二硫鍵的Cys155未能找到, 相應位置被色氨酸占據(圖6B)。在CD4氨基酸多序列比對中, 狼犬、穴兔、綿羊的CD4胞外域相應位置同樣也為色氨酸(圖4)。由于這種差異并沒有破壞樹鼩D2結構的形成, 我們認為色氨酸的存在可能在一定程度上彌補了二硫鍵缺失所帶來的影響, 但這需要進一步實驗驗證。

同時, 人CD4分子中保守性氨基酸殘基Leu134、Leu202、Leu225、Leu308能夠形成疏水域, 而Gln137和Gly306之間能夠形成分子內氫鍵, 它們能夠保證D1和D2之間以及D3和D4之間的緊密連接(Wang et al, 1990)。在樹鼩CD4胞外域的相應位置同樣存在上述保守性氨基酸, 這些氨基酸在維持樹鼩CD4穩定性方面可能起到重要作用。進一步分析發現, 人D1中的α-螺旋在樹鼩中同樣存在,而α-螺旋的存在一定程度可以確保肽鏈的正確折疊和空間結構的形成。綜合以上分析, 我們所獲得的樹鼩CD4分子胞外域能夠形成同人相似的三維空間結構。

人CD4胞外區與MHC-II的結合主要依靠D1、D2結構,特別是D1上的4個帶正電的氨基酸殘基(Lys60、Phe68、Lys71和Arg84)(Wang et al, 2001),但在我們的序列比對結果中發現, 樹鼩CD4分子D1中的后3個核心氨基酸殘基都與人存在差異, 而這種差異在氨基酸多序列比對的其它物種中同樣存在(圖4)。這說明在各物種間CD4與MHC-II結合的氨基酸位點并不保守。CD4的D1結構同時也是大多數單克隆抗體結合的區域, 如BD公司針對人CD4D1區的鼠抗人CD4抗體(克隆號：RPA-T4)。通過人與樹鼩CD4胞外域三維空間結構比較, 我們發現樹鼩在D1區存在兩個N-糖基化位點, 而在人的D1區卻不存在(圖6A, B), 在人CD4 D3中存在一個N-糖基化位點, 在樹鼩CD4分子的D3中未檢測到, 而在樹鼩CD4分子的D4中包含一個人D4結構中不存在的α-螺旋(圖6C, D)。以上差異并沒有導致樹鼩與人CD4胞外域產生較大不同, 其機制有待進一步探討。此外, 我們對人與樹鼩CD4胞外域的絕對電荷分布進行分析, 發現人和樹鼩CD4表面大部分區域均帶正電荷, 負電荷主要分布于D1和D4表面, 且樹鼩D1表面負電荷分布較人D1表面多(圖6E, F)。樹鼩CD4的D1區在N-糖基化位點數目和表面電荷上與人CD4的差異可能影響樹鼩CD4分子與其它分子的結合, 例如我們在實驗中發現鼠抗人CD4抗體不能與樹鼩CD4發生交叉反應。

圖6 人和樹鼩CD4胞外域蛋白三維結構模建和表面電荷比較Fig.6 Modeling of three-dimensional structures and surface charges of the extracellular domain of human and tree shrews CD4 chains

2.2.3 樹鼩CD4胞內域特征

CD4氨基酸多序列比對顯示樹鼩和其它物種的CD4胞內域高度保守(圖4), 提示該結構域參與了CD4分子重要功能。Glaichenhaus et al (1991)報道CD4分子胞內域中KKTCQC基序是Src家族酪氨酸蛋白激酶p56lck的結合區域, 其中的兩個半胱氨酸是CD4與p56結合所必需的(Learmont et al, 1999),而p56lck在去磷酸化激活狀態下, 能夠造成CD3胞內域ITAM的磷酸化, 進而引起fyn和ZAP-70等下游信號分子的激活, 最終完成T細胞活化(Leo & Schraven, 2001; Kane et al, 2000)。在樹鼩CD4胞內域中, 我們同樣檢測到高度保守的KKTCQC基序的存在(圖4), 明確提示樹鼩CD4具有與p56lck結合的結構基礎, 進而參與樹鼩T淋巴細胞的活化。

我們在樹鼩KKTCQC基序上游檢測到兩個保守的絲氨酸殘基和兩個保守的亮氨酸殘基(圖4)。這4個保守氨基酸參與人CD4的內化(internalization),其中兩個保守的絲氨酸殘基的磷酸化是CD4內化的信號, 而CD4分子內化可以下調細胞表面CD4的表達, 控制T淋巴細胞的過度活化, 保持免疫系統的平衡(Shin et al, 1990)。我們推測樹鼩CD4胞內域中的這4個保守性氨基酸亦參與了樹鼩CD4的內化過程。此外, 我們發現以上基序在比對的其他哺乳動物中也同樣存在(圖4), 提示大多數哺乳動物CD4胞內域重要基序在長期進化過程中具有高度的保守性。

綜上, 本研究通過RT-PCR擴增得到樹鼩CD4全長編碼序列, 確定了原預測序列中未知的兩處片段, 同時, 對其分子特征進行了比較分析。結果表明：樹鼩CD4氨基酸序列與人和恒河猴的親緣關系較近, 其胞外域整體結構與人CD4胞外域相似的。而CD4與MHC-II結合相關的4個核心氨基酸在各物種中差異較大, 同時, 胞外域的潛在N-糖基化位點、α-螺旋以及表面電荷的分布也存在差異。這些差異的存在有利于對樹鼩CD4結構與功能特點的進一步分析。

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Cloning of full-length coding sequence of tree shrew CD4 and prediction of its molecular characteristics

TIAN Wei-Wei1,2,3, GAO Yue-Dong4,5, GUO Yan3, HUANG Jing-Fei4,5, XIAO Chang1, LI Zuo-Sheng2,*, ZHANG Hua-Tang3,*

(1. College of Biotechnology, Southwestern University, Beibei 400715, China; 2. Yunnan Walvax Biotechnology Co., LTD Kunming 650106, China; 3. Immunobiology Laboratory, Key Laboratory of Animal Models and Human Disease Mechanisms, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Science, Kunming 650223, China; 4. Kunming Biological Diversity Regional Center of Large Apparatus and Equipment, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 5. State Key Laboratory of Genetic Resources and Evolution, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China)

The tree shrews, as an ideal animal model receiving extensive attentions to human disease research, demands essential research tools, in particular cellular markers and monoclonal antibodies for immunological studies. In this paper, a 1 365 bp of the full-length CD4 cDNA encoding sequence was cloned from total RNA in peripheral blood of tree shrews, the sequence completes two unknown fragment gaps of tree shrews predicted CD4 cDNA in the GenBank database, and its molecular characteristics were analyzed compared with other mammals by using biology software such as Clustal W2.0 and so forth. The results showed that the extracellular and intracellular domains of tree shrews CD4 amino acid sequence are conserved. The tree shrews CD4 amino acid sequence showed a close genetic relationship withHomo sapiensandMacaca mulatta. Most regions of the tree shrews CD4 molecule surface showed positive charges as humans. However, compared with CD4 extracellular domain D1 of human, CD4 D1 surface of tree shrews showed more negative charges, and more two N-glycosylation sites, which may affect antibody binding. This study provides a theoretical basis for the preparation and functional studies of CD4 monoclonal antibody.

Tree shrews; CD4; RT-PCR; Structure; Function; Monoclonal antibody

田巍威, 碩士研究生, E-mail: vivit1986@126.com

Q959.832; Q951.3; Q347

A

0254-5853-(2012)01-0060-07

10.3724/SP.J.1141.2012.01060

2011-10-09；接受日期：2012-01-05

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃)分課題(2007CB512807);中科院知識創新工程重要方向項目(KSCX2-EW-R-12);樹鼩基礎生物學及重要生物學特性研究(Y002732073);中科院昆明動物研究所“動物模型與人類疾病機理重點實驗室”開放課題

?通信作者(Corresponding authors)，E-mail: zhanght@post.kiz.ac.cn; jxdxlzs@yahoo.com.cn