樹鼩神經肽Y的分子克隆及其靈長類類似物的同源性比較

董 麗, 呂龍寶, 賴 仞,*

(1. 中國科學院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室, 中國科學院昆明動物研究所, 云南 昆明 650223;

2. 中國科學院研究生院, 北京 100049)

(1. Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences and Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate University of the Chinese Academy Sciences, Beijing 100049, China)

樹鼩神經肽Y的分子克隆及其靈長類類似物的同源性比較

董 麗1,2, 呂龍寶1, 賴 仞1,*

(1.中國科學院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室,中國科學院昆明動物研究所,云南 昆明650223;

2.中國科學院研究生院,北京100049)

樹鼩由于與靈長類動物有較密切的親緣關系和其個體小，以及繁殖周期短等特性而倍受關注, 尤其是作為醫用實驗動物的研究，近年來已受到越來越多的重視, 但樹鼩的分類地位還一直有所爭論。該研究從樹鼩腦cDNA文庫中克隆得到編碼樹鼩神經肽Y(neuropeptide Y, NPY)前體序列, 序列比對發現該序列與靈長類NPY序列同源性高達96.9%。將該序列與GenBank數據庫中其他物種的NPY序列構建系統進化樹, 發現樹鼩與靈長類處于同一分支。該研究結果揭示了樹鼩與靈長類較近的親緣關系。

神經肽Y; 樹鼩; 靈長類

(1. Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms of the Chinese Academy of Sciences and Yunnan Province, Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223, China; 2. Graduate University of the Chinese Academy Sciences, Beijing 100049, China)

神經肽Y(neuropeptide Y, NPY)是Tatemoto et al (1982)首次從豬腦中提取純化出的一種具有生物活性的內源性信息物質, 由36個氨基酸組成, 相對分子質量為4.2×103。在結構和功能上與胰多肽(avian pancreatic polypeptide, APP)和肽YY(peptide YY, PYY)非常相似, 所以將其劃分為胰多肽家族(Tatemoto et al,1982)。NPY序列N端和C端各有一個酪氨酸殘基, C端酪氨酸殘基存在酰胺化修飾(Allen et al,1987), 這與生物體內許多活性肽(如促性腺激素GnRH)相同(Cerdá-Reverter & Larhammar, 2000)。這一修飾不僅可保護C端免受羧肽酶降解,同時與生物活性密切相關。N端的酪氨酸殘基對于NPY三級結構的穩定及與NPY受體的結合非常重要(Tatemoto et al,1982)。

在細胞內, NPY以前體方式合成, 前體由97～98個氨基酸組成, N端28～29個氨基酸為信號肽,前體翻譯后經過酶切、C端酪氨酸酰基化修飾后成為具有生物活性的36個氨基酸組成的活性肽(Higuchi et al,1988)。NPY在進化過程中高度保守,哺乳動物中, 人以及大鼠、豚鼠的成熟NPY氨基酸序列完全相同, 而豬的NPY也只是在第17位氨基酸有所不同，魚類電鰩目黑斑電鰩(Torpedo marmorata)有33個氨基酸與哺乳動物NPY序列中一致，只有另外3個不同(Pedrazzini et al，2003)。

NPY最初從哺乳動物中分離得到, 之后的研究發現, NPY不僅在哺乳動物中表達, 也廣泛分布于鳥類、魚類和兩棲類。在體內, 神經肽作為一種神經遞質參與體內多種生理調節過程。NPY可直接對下丘腦活動產生作用, 影響多種因子與激素的合成和分泌(Danger et al,1990; Breton et al,1991); NPY可促進機體的攝食行為, 調節機體能量平衡(Kuo et al, 2007); 調節血管收縮, 具有增強血管緊張素II(AngII)、內皮素和交感縮血管物質(NE)等血管收縮物質而抑制舒血管物質的作用, 并且與免疫功能也有著密切關系(Zukowska et al, 2003)。除成熟肽以外, 前體加工過程中C端切割產生的30個氨基酸組成的肽段(CPON)也非常保守。有研究表明, CPON廣泛分布于中樞和外周神經系統中,并且與NPY在神經細胞中有相同的定位(Gulbenkian et al,1985; Marti et al,1990)。這似乎表明，CPON并不僅僅是NPY加工過程中的一個“副產物”, 它可能還發揮著其他的生物學功能, 遺憾的是, 目前仍沒有發現該肽段的生物學功能。

樹鼩是一種小型哺乳動物, 由于與靈長類相近,近年來受到越來越多科學工作者的關注。該文采用樹鼩腦組織為材料, 構建cDNA文庫, 以PCR方法擴增得到一條編碼樹鼩NPY前體的cDNA序列。

1 材料與方法

1.1 樹鼩腦cDNA文庫的構建

取成年樹鼩(Tupaia belangeri, 來自昆明動物研究所實驗動物中心) 1只，麻醉劑麻醉后, 解剖頭部取出整個腦組織, 立即放入液氮中保存備用。總RNA提取采用Trizol試劑(invitrogen), 參照試劑說明書進行。cDNA雙鏈合成采用CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit試劑盒。一鏈使用CDSIII引物5'-ATTCTAGAGGCCG AGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3' (N=A、G、C、T; N-1=A、G、C)和SmartV寡聚核苷酸5'-AAGCA GTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3'合成；二鏈使用5'PCR引物5'-AAGCAGTGGTATCAACG CAGAGT-3'合成。

1.2 克隆篩選

對上一步構建的cDNA文庫進行隨機克隆篩選, 根據構建cDNA文庫時5'端和3'端通用序列設計引物, 上游引物和下游引物分別為：5'-AAGCAGTGGTATC-AACGCAGAGT-3'和5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3', 引物由上海生物工程有限公司合成。以上一步smart合成雙鏈cDNA為模板進行PCR。反應條件如下：首先95 °C變性5 min；接下來95 °C變性30 s, 55 °C退火30 s, 72 °C延伸1 min, 30個循環；最后72 °C延伸10 min。PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測, 切膠回收, 克隆到PMD19-T載體(TaKaRa公司), 選擇103個陽性克隆測序。

1.3 克隆序列與其他物種神經肽Y前體序列比對

克隆得到的序列, 采用美國國家生物技術信息中心(NCBI, National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)網站的BLAST 軟件, 將測序后獲得的cDNA序列與GenBank數據庫中已公布的序列進行同源性比對。

1.4 樹鼩神經肽Y前體序列分子進化分析

根據BLAST比對結果, 從GenBank中下載其他物種神經肽Y前體序列, 采用MEGA5.0軟件(Tamura et al, 2011)鄰近歸并法(neighbor joining method)構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 樹鼩腦cDNA文庫構建

提取的RNA經紫外分光光度計及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 結果顯示RNA濃度為882 ng/μL, OD260/OD280值為2.01, RIN值為8.28S/18S值1.7,各指標均符合后續建庫要求。以所提RNA按照SMARTTMcDNA Library Construction Kit試劑盒操作手冊建立cDNA文庫, 電泳檢測顯示250～2 000 bp位置有連續彌散狀, 符合說明書要求, 可作為模板進行后續實驗。

2.2 樹鼩NPY序列克隆及序列比對

圖1 樹鼩腦組織cDNA文庫中克隆所得NPY核苷酸序列及對應氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequence encoding neuropeptide Y (NPY) and corresponding amino acid sequence from Tupaia belangeri

將PCR擴增所得序列測序, 得到一條長度為291 bp的核苷酸序列, 其核苷酸序列如圖1所示。經Blast比對, 此片段與數據庫中人類NPY前體序列非常類似, 推測該序列編碼蛋白為樹鼩中NPY前體。291 bp為樹鼩NPY前體序列編碼區, 可編碼97個氨基酸組成的NPY前體。其中前84 bp核苷酸序列編碼28個氨基酸組成的信號肽, 中間108 bp核苷酸編碼長度為36個氨基酸的成熟肽。

2.3 樹鼩NPY前體序列與其靈長類類似物同源性比較

將克隆得到樹鼩NPY前體序列與GenBank數據庫靈長類中獼猴(Macaca mulatta登錄號NP_001027986.1)、人(Homo sapiens登錄號AAA59944.1)NPY前體序列進行同源性比對。結果顯示，樹鼩NPY前體序列成熟肽36個氨基酸與靈長類3個物種完全一致, 信號肽部分28個氨基酸也僅在第3、6、26位存在3個氨基酸的差異, 整個前體肽序列97個氨基酸中有94個氨基酸完全一致,同源性高達96.9%。

圖2 樹鼩NPY前體序列與其靈長類類似物序列比對Fig.2 Comparison of Tupaia belangeri NPY precursor with Primates NPY precursors

2.4 樹鼩神經肽Y前體序列分子進化分析

將克隆所得樹鼩NPY前體與人(Homo sapiens, GenBank登錄號AAA59944.1)、獼猴(Macaca mulatta, NP_001027986.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus, NP_036746.1)、小家鼠(Musmusculus, NP_075945.1)、紅原雞(Gallus gallus, NP_990804.1)、家鴿(Columba livia, ACB86930.1)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis, AAA49914.1)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis, AAI35388.1)、七鰓鰻(Lampetra fluviatilis, AAA21352.1)、金魚(Carassius auratus, P28672.1)、錦鯉(Cyprinus carpio, Q9DGK7.1)、黃牛(Bos taurus, AAR37328.1)、白頰長臂猿(Nomascus leucogenys, XP_003270460.1)、綿羊(Ovis aries, CAD10677.1) NPY前體序列構建系統進化樹, 從圖3可以看出, NPY雖然在進化過程中序列高度保守, 但也存在種屬特異性。樹鼩與靈長類處于同一分支, 說明兩者親緣關系較近。

圖3 神經肽Y(NPY)氨基酸序列系統進化樹Fig.3 Evolutionary tree of Neuropeptide Y amino acid sequence

3 討 論

NPY在生物體中分布廣泛, 目前通過分離純化和克隆手段已經在多個物種中發現其類似物的存在, 包括脊椎動物和無脊椎動物(Blomqvist et al, 1992)。通過不同物種間的序列比對發現, NPY序列高度保守, 特別是發揮生物學活性的成熟肽序列部分。本研究從樹鼩腦組織cDNA文庫中克隆得到了一條相似的序列, 推測該序列在樹鼩體內發揮著和其他物種類似的生物學功能。

長久以來, 樹鼩的系統分類地位一直存在爭議,有人主張將其歸入食蟲目, 有人認為應該屬于靈長目, 后來又有人提出它們既不屬于靈長目, 也不屬于食蟲目, 而是一個獨立的目, 稱為攀鼩目(Chen et al, 2011; Peng et al, 1991)。本研究通過克隆所得的樹鼩NPY前體序列與靈長類類似物進行同源性比對發現, 樹鼩NPY成熟肽序列與其他靈長類完全吻合, 信號肽序列也僅存在3個氨基酸的差異. 但同時將靈長類NPY前體序列與其他物種進行比對發現, NPY成熟肽高度保守, 所以單從成熟肽序列不能判斷樹鼩與靈長類之間親緣關系。不過雖然各物種間NPY成熟肽序列高度保守, 但信號肽部分保守程度卻較低, 存在種屬特異性, 因此，本研究選用NPY前體序列構建系統進化樹來進行研究。從構建的進化樹(圖3)可以看出, 該樹準確定位了魚類、兩棲類、鳥類和哺乳類的親緣關系, 說明以NPY前體序列構建的系統進化樹具有較高的可信度。從該進化樹還可以看出, 樹鼩與靈長類親緣關系更近,說明樹鼩與靈長類更相似。

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Molecular cloning ofTupaia belangeri chinensisneuropeptide Y and homology comparison with other analogues from primates

DONG Li1,2，Lü Long-Bao1, LAI Ren1,*

Much attention has been payed to tree shrews for their close phylogenetic relationship with primates, small size, and short reproductive cycle. Especially, they are considered as excellent experiential animals for medicine or/and disease research. A nucleotide sequence encoding neuropeptide Y(NPY) precursor has been cloned from the cDNA library ofTupaia belangeri chinensis. Sequence alignment revealed that the sequence homology with primate NPY was up to 96.9%. The phylogenetic analysis based on NPY precursor sequence revealed that the tree shrew has a close relationship with primates.

Neuropeptide Y;Tupaia belangeri chinensis; Primates

Q959.832; Q951.3; Q347

A

0254-5853-(2012)01-0075-04

10.3724/SP.J.1141.2012.01075

2011-10-31；接受日期：2011-12-29

中國科學院基礎前沿研究專項項目(KSCX2-EW-R-11, KSCX2-EW-J-23);中國科學院和云南省動物模型與人類疾病機理重點實驗室資助項目

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: rlai@mail.kiz.ac.cn