EV71可感染幼齡中緬樹鼩

王文廣, 黃曉燕, 徐 娟, 孫曉梅, 代解杰, 李琦涵

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心, 云南 昆明 650118)

EV71可感染幼齡中緬樹鼩

王文廣, 黃曉燕, 徐 娟, 孫曉梅, 代解杰*, 李琦涵*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 全國(guó)醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心,云南 昆明650118)

樹鼩是靈長(zhǎng)類動(dòng)物的近親, 且具有體型小、繁殖周期短、飼養(yǎng)管理成本低等優(yōu)點(diǎn), 長(zhǎng)期以來被認(rèn)為有望替代靈長(zhǎng)類動(dòng)物用于人類疾病的動(dòng)物模型研究。該文研究了腸道病毒EV71對(duì)幼年中緬樹鼩的感染特點(diǎn), 探索建立EV71感染樹鼩動(dòng)物模型及替代靈長(zhǎng)類動(dòng)物的可行性。實(shí)驗(yàn)分別采用灌胃、滴鼻和尾靜脈注射3種方式, 感染3月齡樹鼩，定期觀察動(dòng)物臨床癥狀和血常規(guī)變化和定期采集血液和糞便樣品, 并使用中和抗體試驗(yàn)、reverse transcription-PCR (RT-PCR)和Real-Time PCR 等技術(shù), 檢測(cè)相關(guān)樣品中和抗體效價(jià)、病毒核酸及載量變化。 結(jié)合組織病理學(xué)檢查, 分析感染病變特點(diǎn)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組樹鼩體溫在第4天前后開始升高, 白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也有類似趨勢(shì); 3種攻毒方式均可檢測(cè)到病毒載量, 峰值出現(xiàn)在第10天前后, 灌胃途徑尤為明顯，血清的最大中和抗體效價(jià)為1:16。感染EV71病毒的樹鼩2周左右出現(xiàn)急性松弛性癱瘓, 大體解剖發(fā)現(xiàn)伴有尿潴留癥狀，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在腦、肺、腸、脾臟、腎臟等部位發(fā)生病變。結(jié)果表明, EV71病毒通過灌胃、滴鼻和靜脈注射3種方式均可以感染中緬樹鼩, 并使之出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)及相關(guān)病變, 該實(shí)驗(yàn)為將來研究EV71感染樹鼩致病機(jī)理、建立手足口病樹鼩動(dòng)物模型奠定了理論基礎(chǔ)。

手足口病; EV71; 中緬樹鼩; 動(dòng)物模型

手足口病是由腸道病毒引起的傳染病, EV71是手足口病的主要致病原之一, 可使患者并發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和相關(guān)心肺功能衰竭等臨床癥狀, 嚴(yán)重威脅世界各地嬰、幼兒的生命健康，目前尚無有效藥物或疫苗。建立合適的動(dòng)物模型是深入基礎(chǔ)研究和進(jìn)行藥物評(píng)價(jià)的關(guān)鍵之一。國(guó)內(nèi)外已有EV71感染小鼠的報(bào)道, 先后建立了乳鼠(Lin et al, 2009)和成年小鼠(Duo et al, 2009)的感染模型，但乳鼠個(gè)體過小, 不便操作且發(fā)病期太短；成年小鼠不易感染, 無法滿足藥物或疫苗的評(píng)價(jià)工作需要。非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型較有前景。Nagata et al (2004)通過靜脈注射建立了EV71感染獼猴的模型, 呈現(xiàn)與人腦炎類似的臨床體征與神經(jīng)病理。Liu et al (2011)已成功使嬰猴感染EV71, 并建立了較為可行的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型固然理想, 然而成本昂貴, 研究周期長(zhǎng), 動(dòng)物倫理審查嚴(yán)格。樹鼩作為一種新開發(fā)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 進(jìn)化上接近靈長(zhǎng)類(Sargis, 2004), 生理代謝與人類有諸多相似之處, 具有較大的科研潛力, 再加上飼養(yǎng)方便、成本低廉, 具備建立理想動(dòng)物模型的先天優(yōu)勢(shì)。近年來的研究成果表明, 樹鼩對(duì)多種人類常見疾病具有再現(xiàn)的潛質(zhì), 人們已經(jīng)較成功地建立了肝炎等多種病毒感染性疾病模型(Wang et al, 2010)。Wang et al (2011)報(bào)道野生中緬樹鼩攜帶有腸道病毒中的柯薩奇病毒, 提示樹鼩可能對(duì)腸道病毒易感。本文研究了EV71對(duì)中緬樹鼩的感染能力, 探索建立其動(dòng)物模型的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)人工繁育的F1代3月齡中緬樹鼩14只, 雌雄各半, 體重（120±20）g, 來自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類中心。

1.1.2 毒株 EV71標(biāo)準(zhǔn)毒株(FY-23), 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室分離并饋贈(zèng)。Vero細(xì)胞培養(yǎng), 滴度測(cè)定為8.5×108TCID50/mL。

1.1.3 儀器 動(dòng)物血球分析儀HEMAVET 950、歐姆龍MC-140電子體溫計(jì)、日立臺(tái)式離心機(jī)CT15RE、MyCycler PCR 儀、CFX 96 實(shí)時(shí)定量 PCR 儀、ND-1000微量紫外可見分光光度計(jì)和Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱等儀器。

1.1.4 試 劑 Minimum essential medium (MEM)液體培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)、RNA提取試劑RNAiso Plus (大連寶生物:D9108A)、逆轉(zhuǎn)錄試劑RT Master Mix (大連寶生物:DRR036A)、PCR試劑2×GoldStar Taq MasterMix (北京康為世紀(jì):CW0960)和實(shí)時(shí)定量PCR試劑GoldStar TaqMan Mixture(北京康為世紀(jì):CW0932)等試劑, 以及引物探針均由大連寶生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 挑選14只三月齡健康樹鼩, 雌雄各半。動(dòng)物隨機(jī)分組：灌胃組、滴鼻組和靜脈注射組, 每組4只, 雌雄各半, 另兩只設(shè)對(duì)照組(表1)。本方案經(jīng)醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

表1 分組感染表Tab. 1 Tupaia belangeri with EV71 infection in groups A-D

1.2.2 日常觀察 攻毒后每天觀察動(dòng)物活動(dòng)狀況、精神狀態(tài), 以及飲食、大便等。每天9:00測(cè)量記錄動(dòng)物肛溫, 保定動(dòng)物待其處于平靜狀態(tài), 使用歐姆龍MC-140電子體溫計(jì)測(cè)量記錄動(dòng)物肛溫。

1.2.3 血樣采集 攻毒前采尾靜脈血做本底, 攻毒后3 d 1次, 每次采集0.6 mL。先分取100 μL血樣用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝做血常規(guī)檢測(cè), 其余分離血清?20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 血常規(guī)檢測(cè) 根據(jù)上述血樣采集方案制備EDTA-2Na抗凝血, 按照動(dòng)物血球分析儀HEMAVET 950操作說明進(jìn)行血細(xì)胞的測(cè)定。

1.2.5 糞便采集 從攻毒前1 d開始, 每天8:30采集糞便, 取樣1～2 g。采集糞便用添加雙抗(青霉素和鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液(PBS)混制成20%懸液,凍融處理后離心取上清?20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 抗體中和試驗(yàn) 待測(cè)血清樣品統(tǒng)一56 ℃滅活30 min, 用MEM細(xì)胞培養(yǎng)液從2倍、4倍系列稀釋到32倍。于96孔板中, 分別將各梯度稀釋樣品50 μL, 與等體積100TCID50的 EV71 37 ℃中和2 min, 平行4孔, 每塊培養(yǎng)板均設(shè)血清、病毒和細(xì)胞對(duì)照，加入Vero細(xì)胞懸液100 μL, 細(xì)胞終濃度為2×105個(gè)/mL, 于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)7 d, 將能使50%細(xì)胞孔不產(chǎn)生病變的最高稀釋度的倒數(shù)定為該血清的中和效價(jià)。每次試驗(yàn)均設(shè)病毒回滴試驗(yàn), 且回滴結(jié)果在32～320 TCID50/孔時(shí), 試驗(yàn)判為成立(Mao et al, 2010 )。

1.2.7 EV71核酸檢測(cè) 1) 應(yīng)用RNAiso Plus (TaKaRa:D9108A) 等試劑分別提取血清和糞便上清中總RNA, 使用RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2) 常規(guī)PCR：以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板, 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按照北京康為世紀(jì)的2×GoldStar Taq MasterMix試劑盒進(jìn)行操作, 根據(jù)EV71 FY-23 (GenBank:EU812515) 基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物。上游引物EV71-S(2369-2388)：5′-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3′; 下游引物EV71-A(2 576-2 595)：5′-ATTTCAGCAGCTTGGAG TGC-3′; PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度226 bp。

針對(duì)研究組實(shí)施鈣劑緩慢靜脈滴注補(bǔ)鈣給藥治療,要將劑量為4.00nl/(kg·d)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.00%的葡萄糖酸鈣藥物制劑溶解到總體積為150.00ml的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.00%的葡萄糖注射液之中為患者完成靜脈滴注補(bǔ)鈣給藥治療過程,要在患者具體開展靜脈滴注給藥治療過程中,嚴(yán)格做好滴速控制工作,支持和保障患者的持續(xù)給藥治療時(shí)間在3.00-4.00時(shí)間區(qū)間之內(nèi),該組患者的每天給藥次數(shù)為兩次,持續(xù)給藥治療時(shí)間為7天。

3) Real-time PCR：同樣以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板, 標(biāo)準(zhǔn)品定量稀釋梯度為107、106、105、104拷貝/μL, 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件按北京康為世紀(jì)的GoldStar TaqMan Mixture試劑盒進(jìn)行操作, 根據(jù)EV71 FY-23 (GenBank:EU812515) 基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物探針。上游引物EV71-F(2 828-2 848)：5′-CGCTTTGACGCAGAGTTCACT-3′; 下游引物EV71-R (2 877-2 897)：5′-TTGGAGCAATTGTGGGA CGA-3′; 探針EV71-P(2 849-2 870)：5′-FAM-TTGTT GCGTGCACACCCACCG-BHQ1-3′。

1.2.8 組織病理學(xué)檢查 出現(xiàn)急癥動(dòng)物及時(shí)處死解剖, 取出腦、肺、心、腸、脾、腎等相關(guān)組織器官, 中性福爾馬林溶液固定, 常規(guī)石蠟包埋, 2 μm切片, 蘇木素?伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色,光鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1 臨床觀察

實(shí)驗(yàn)組樹鼩在攻毒后3 d開始出現(xiàn)黑褐色稀便, 1周左右開始出現(xiàn)活動(dòng)異常, 飲食下降, 跳躍活動(dòng)減少。體溫監(jiān)測(cè)顯示, 3組樹鼩均在第4天前后開始上升, 第6天前后達(dá)到最高, 之后開始回落到正常水平(圖1)。2周后大于半數(shù)樹鼩先后出現(xiàn)急性松弛性癱瘓, 蜷縮萎靡, 樹鼩后腿松弛拖拉, 不能正常活動(dòng), 靠前腿拖行, 精神極度萎靡, 眼眶下陷, 雙目呆滯。半數(shù)樹鼩于18 d前后死亡，其中觀察到灌胃組的4號(hào)樹鼩嘴角和前掌出現(xiàn)小皰疹(圖2)。

圖1 EV71感染樹鼩體溫變化趨勢(shì)Fig. 1 Changes in the body temperature of EV71 infected Tupaia belangeri

2.2 血常規(guī)檢測(cè)

血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果顯示, 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組樹鼩白細(xì)胞(WBC)均呈現(xiàn)一個(gè)升降波動(dòng), 波動(dòng)發(fā)生在第5天到第15天之間, 淋巴細(xì)胞(LYM)有相似的變化趨勢(shì)(圖3、圖4)。

2.3 中和抗體試驗(yàn)

抗體中和試驗(yàn)結(jié)果顯示樹鼩血清中存在EV71抗體(表2), 最早出現(xiàn)在感染EV71后第3天, 其中靜脈注射組中9號(hào)動(dòng)物于第12天出現(xiàn)最高效價(jià)1:16, 各實(shí)驗(yàn)組均有抗體檢出, 在攻毒3周后仍然可以檢測(cè)到中和抗體。

圖3 EV71感染樹鼩白細(xì)胞變化趨勢(shì)Fig. 3 Changes in the WBC of EV71 infected Tupaia belangeri

圖4 EV71感染樹鼩淋巴細(xì)胞變化趨勢(shì)Fig. 4 Changes in the LYM of EV71 infected Tupaia belangeri

表2 EV71感染樹鼩的中和抗體檢測(cè)結(jié)果Tab. 2 Neutralizing antibody of EV71 infected in Tupaia belangeri

2.4 核酸檢測(cè)

2.4.1 普通PCR檢測(cè)EV71 RNA 普通PCR產(chǎn)物大小為226 bp, 其中血清樣品檢測(cè)到陽(yáng)性的有灌胃組2、3、4號(hào), 滴鼻組6號(hào)和靜脈注射組的9、11號(hào)(圖5a); 糞便樣品實(shí)驗(yàn)組全部檢測(cè)到陽(yáng)性(圖5b);對(duì)4號(hào)樹鼩皰疹部位用棉試子取樣, 核酸檢測(cè)到陽(yáng)性(圖5c), 其中0為陽(yáng)性對(duì)照, ①、②分別檢自樹鼩嘴角和腳掌部位。

2.5 病理學(xué)檢查

組織病理學(xué)檢查結(jié)果(圖10)顯示實(shí)驗(yàn)組樹鼩的腦部出現(xiàn)組織變性壞死、水腫、膠質(zhì)細(xì)胞增生。肺部出現(xiàn)肺水腫、慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)、局部纖維組織增生等病理變化。心臟出現(xiàn)心肌組織充血、局部間隙有炎細(xì)胞聚集。腸道壁變薄脫落、黏膜上皮細(xì)胞缺損壞死、局部黏膜息肉樣增生。脾臟充血、玻璃樣變、脾竇擴(kuò)張等。腎臟局部皮質(zhì)充血、腎小球旁有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖5 感染樹鼩EV71 RNA 的檢測(cè)Fig. 5 EV71 RNA of infected Tupaia belangeri

圖6 感染樹鼩血清中病毒載量的變化Fig. 6 Changes in the viral load from the serum of EV71 infected Tupaia belangeri

圖7 灌胃EV71感染樹鼩糞便樣品載量變化Fig. 7 Changes in the fecal viral load of EV71 infected Tupaia belangeri (Oral administration group)

圖8 滴鼻EV71感染樹鼩糞便樣品載量變化Fig. 8 Changes in the fecal viral load of EV71 infected Tupaia belangeri (Nasal dripping group)

圖9 靜脈注射EV71感染樹鼩糞便樣品載量變化Fig. 9 Changes in the fecal viral load of EV71 infected Tupaia belangeri (Tail intravenous injection group)

3 討 論

EV71危害嬰、幼兒健康的關(guān)鍵在于對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的破壞, 繼而誘發(fā)肺水腫、心肺衰竭等重癥,甚至危及生命。本研究通過3種不同途徑感染樹鼩,誘發(fā)了急性松弛型癱瘓、樹鼩活動(dòng)能力喪失, 精神低迷、眼眶內(nèi)陷等癥狀, 與Chen et al(2004)建立的EV71口服感染乳鼠模型癥狀相吻合；而Nagata et al(2002)通過椎管注射方式建立的食蟹猴模型也出現(xiàn)一系列與人體臨床癥狀相近的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀, 如震顫、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等。另外, 我們通過樹鼩大體解剖發(fā)現(xiàn)的尿潴留現(xiàn)象也與一些EV71重癥患者的臨床表現(xiàn)一致。

圖10 EV71感染樹鼩的組織病理變化(HE，×100)Fig. 10 Pathological changes in the tissues of Tupaia belangeri infected with EV71 ( HE,×100)

我們建立的樹鼩模型組織病理學(xué)檢查結(jié)果(圖10)顯示樹鼩的腦部出現(xiàn)組織變性壞死、水腫, 提示EV71病毒可能已經(jīng)侵害樹鼩的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Dong et al(2010)通過靜脈注射和呼吸道感染兩種途徑建立獼猴模型, 也出現(xiàn)類似的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變。我們還發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)樹鼩肺部出現(xiàn)水腫、慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)、局部纖維組織增生等癥狀, 這些與Liu et al(2011)的EV71 型手足口病肺組織病理學(xué)研究基本一致, 支持了EV71可引發(fā)神經(jīng)性肺水腫等并發(fā)癥的論斷(Xu et al, 2008)。實(shí)驗(yàn)樹鼩心臟出現(xiàn)心肌充血、局部間隙有炎細(xì)胞聚集, 這些變化提示病變樹鼩可能有心臟功能受損。腸道病毒首要侵害部位就是腸道,本實(shí)驗(yàn)中樹鼩腸道壁變薄脫落、黏膜上皮細(xì)胞缺損壞死、局部黏膜息肉樣增生等癥狀也恰恰符合了腸道病毒的感染特性。在實(shí)驗(yàn)樹鼩的腎臟局部發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)充血、腎小球旁有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。另外,感染EV71的樹鼩也出現(xiàn)了與人類似的手足口皰疹。

我們的實(shí)驗(yàn)樹鼩在感染EV71病毒后出現(xiàn)了與人類似的體溫上升現(xiàn)象, 與Liu et al(2011)建立的嬰猴模型一致。血常規(guī)白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的變化也與人的病癥相符, 在經(jīng)過一次上升之后開始下降, 并且有低于正常水平的趨勢(shì)。中和試驗(yàn)也檢測(cè)到了抗體的產(chǎn)生(表2), 樹鼩產(chǎn)生的抗體可以中和EV71。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分樹鼩在感染EV71后3周左右體內(nèi)仍有抗體存在, 說明樹鼩對(duì)人的EV71毒株有相當(dāng)?shù)母腥具m應(yīng)性, 可在藥物或疫苗評(píng)價(jià)等研究中發(fā)揮積極有效的作用。另外, 可能由于樹鼩個(gè)體差異等因素使得抗體的產(chǎn)生并沒有表現(xiàn)一致的規(guī)律性, 而中和抗體效價(jià)比乳鼠模型較低(Arita et al, 2007)，可能是物種差異等所致。從免疫學(xué)角度來看,如果制備樹鼩專用的ELISA檢測(cè)試劑盒, 將會(huì)豐富檢測(cè)指標(biāo)和提高檢測(cè)效率。我們主要采用分子生物學(xué)手段檢測(cè)樹鼩感染病毒的狀況, 其中Real-time PCR可以精確檢測(cè)病毒在樹鼩體內(nèi)的載量變化, 可以看出病毒在樹鼩體內(nèi)復(fù)制10 d前后出現(xiàn)峰值, 之后有所下降。樹鼩2周前后發(fā)病, 重病者18 d左右死亡, 從感染病毒到發(fā)病的時(shí)間與嬰猴模型(Liu et al, 2011)比較接近。總的看來, 以上的這一整套檢測(cè)方案切實(shí)可行, 這為樹鼩模型的建立評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

EV71作為腸道病毒自然感染途徑有消化道和呼吸道(Chen et al, 2010)。在動(dòng)物建模方法上, 先后有人經(jīng)由口服和鼻腔途徑成功感染小鼠(Lin et al, 2009)、獼猴(Liu et al, 2011)。本研究將EV71通過灌胃、滴鼻和靜脈注射3種途徑感染樹鼩, 在血液和糞便樣品中均檢測(cè)到病毒載量。靜脈注射在很多病毒感染中都可以普遍實(shí)現(xiàn), 但非自然感染途徑;而滴鼻和灌胃更符合EV71自然感染的特點(diǎn), 其中灌胃略勝一籌, 感染方法證實(shí)可行。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，樹鼩可通過灌胃或滴鼻等自然感染途徑來建立其動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)發(fā)病樹鼩的臨床表現(xiàn)、感染周期以及病理病變等感染特性說明, 樹鼩模型比小鼠模型更接近人的發(fā)病情況, 而與獼猴動(dòng)物模型相比, 樹鼩具有體型小、實(shí)驗(yàn)周期短、便于飼養(yǎng)管理且成本低廉等優(yōu)越性, 可望替代靈長(zhǎng)類動(dòng)物用于人類手足口疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)理及預(yù)防和治療的研究。本次試驗(yàn)半數(shù)動(dòng)物最終發(fā)病死亡, 提示需要研究攻毒最適劑量。另外，我們還將研究不同年齡樹鼩的感染能力, 從而找到最適年齡的樹鼩做模型研究。如果能從樹鼩體內(nèi)不同器官組織分離并鑒定出病毒, 繼而進(jìn)行傳代感染適應(yīng), 通過人工繁殖技術(shù)培育對(duì)EV71敏感的攜帶病毒的樹鼩種群, 將對(duì)開展手足口疾病的動(dòng)物模型建立、藥物篩選和疫苗評(píng)價(jià)具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

通過本研究, 我們成功建立了中緬樹鼩感染EV71的動(dòng)物模型。通過對(duì)該動(dòng)物模型的系統(tǒng)研究,我們擬定了EV71感染中緬樹鼩動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)：1)動(dòng)物臨床表現(xiàn)：潛伏期一般5 d左右。體溫升高, 活動(dòng)減少, 飲食下降, 糞便稀黑; 樹鼩嘴腳部位可見皰疹, 重癥出現(xiàn)急性松弛型癱瘓, 或伴有尿潴留, 部分急癥可致死亡。2)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果：血常規(guī)可見白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞水平升高， 血清中可檢測(cè)到抗EV71中和抗體，血清和糞便中可檢測(cè)到病毒核酸，rReal-time PCR可監(jiān)測(cè)血液、糞便等樣品中病毒載量變化。3)病理學(xué)變化：可見心、腦、肺、腸、腎、脾等部位病變, 如表現(xiàn)有腦組織壞死、水腫, 肺水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn), 心肌充血、伴有炎癥, 腸壁脫落、黏膜上皮細(xì)胞壞死, 腎脾充血炎癥等。我們的這些研究成果相信將為以后建立成熟的EV71動(dòng)物模型提供科學(xué)依據(jù), 為深入了解EV71的致病機(jī)理和開發(fā)有效的藥物疫苗構(gòu)建科研平臺(tái), 同時(shí)這對(duì)樹鼩資源在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用也具有很大的現(xiàn)實(shí)意義。

致謝：感謝醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所病毒免疫室趙樹棟等老師提供EV71病毒株以及在病毒培養(yǎng)技術(shù)方面給予的幫助。

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Experimental studies on infantTupaia belangerichineseswith EV71 infection

WANG Wen-Guang, HUANG Xiao-Yan, XU Juan, SUN Xiao-Mei, DAI Jie-Jie*, LI Qi-Han*

(The Medical Primate Research Center of China, Institute of Medical Biology, the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Kunming 650118, China)

Tupaia belangeriare small mammals with a squirrel-like appearance; they were formerly classified under the primates order despite the lack of derived features characteristic of primates. Given thatT. belangeriare easy to raise, cheap to maintain, and have a small body size, a high reproductive rate, and close affinity to primates, these animals would be used as an alternative to primates in biomedical research. Three-month oldT. belangeri chineseswere infected with enterovirus 71 (EV71) via three different routes, namely, oral administration, nasal dripping, and tail intravenous injection, to study the infection in infantT. belangeriand find a feasible scheme to make them an ideal animal model of EV71 in place of primates. Daily activities were regularly observed, body temperatures were measured, and blood tests were conducted. Blood and fecal samples were regularly collected. The infection was examined via the neutralizing antibody test, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), Real-Time PCR, and pathological analysis. The temperature, as well as the white blood cell count and the number of lymphocytes, increased four days after infection. Virus loads were determined in all three groups, and the peak appeared on, before, or after the tenth day, respectively. Thus, oral administration proved to be the best route. The highest serum antibody titer obtained was 1:16. Acute paralysis with urinary retention manifested after about two weeks, and pathological changes were observed in the brain, heart, lung, spleen, kidney, and other tissues. In conclusion,T. belangeri chinesescan infected with EV71 via oral administration, nasal dripping, and tail intravenous injection. Therefore,T. belangeriare potential EV71 animal models for further studies on the mechanism of pathogenesis or vaccine evaluation.

book=8,ebook=345

Hand-foot-mouth disease; EV71 virus;Tupaia belangeri chineses; Animal model

Q95-33; R373; Q959.837

A

0254-5853-(2012)01-0007-07

10.3724/SP.J.1141.2012.01007

2011-10-27；接受日期：2012-01-10

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2009BAI83B02; 2011BAI15B01);云南省科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目(2006PT07-2);國(guó)家“973”計(jì)劃項(xiàng)目(2011CB504903);國(guó)家自然科學(xué)基金(81171573);云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃面上項(xiàng)目(2011FB116)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail：djj@imbcams.com.cn; imbcams.lq@gmail.com

王文廣,男,碩士研究生,研究方向：人類疾病動(dòng)物模型研究; Email:windgone@imbcams.com.cn