春蘭根狀莖多倍體誘導試驗

徐曉薇，王麗芳，錢仁卷，楊燕萍

(浙江省農業(yè)科學院 亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

蘭科植物的自然變異較為豐富，長期以來人們從采挖的大量植株中發(fā)現(xiàn)奇異單株，但這種從野生變異中選擇品種的做法造成了蘭花盲目、掠奪性的采挖，造成珍貴種質資源的外流。由于野生資源整體上趨于減少，自然變異產生的新品種數(shù)量也會變得越來越少。采用人工技術改良或創(chuàng)造新種質成了重要的方法之一，其中誘變技術是改良品種快速便捷的手段。本文以春蘭的F1根狀莖為材料，研究秋水仙素處理對春蘭根狀莖生長、分化和誘變效應，為春蘭多倍體誘變育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以春蘭F1根狀莖繼代繁殖幾代后穩(wěn)定生長的根狀莖為材料。

1.2 方法

1.2.1 根狀莖的浸泡處理

將生長較為一致的1 cm左右根狀莖浸入到含不同濃度秋水仙素 (0，0.10%，0.20%)的溶液中，分別進行不同時間處理。A1-A4用0.05%秋水仙素分別處理 1，2，3，4 min;B1-B4用0.10%秋水仙素分別處理1，2，3，4 min;C1-C4用0.20%秋水仙素分別處理1，2，3，4 min;以清水為對照 (CK)。每處理6瓶，每瓶10個根狀莖。處理條件為25℃，搖床轉速90 r·min-1。

1.2.2 處理材料的培養(yǎng)和觀察

將處理后的根狀莖接到分化培養(yǎng)基 (1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1)上，(26±1)℃下每天光照12 h。培養(yǎng)過程中觀察根狀莖的生長情況，記錄根狀莖受害率、分化率和生長狀態(tài)等。受害率/%=受傷害的個體數(shù)/存活外植體數(shù)。分化率/%=分化出苗的個體數(shù)/存活外植體數(shù)。

誘導率/%=嵌和體+四倍體/取材數(shù)。

加倍率/%=四倍體/取材數(shù)。

將分化苗接到生根培養(yǎng)基 (1/2MS+NAA 2.0 mg·L-1+AC 2.0 g·L-1)上。

1.2.3 細胞學染色體的觀察

取分化出苗的分裂增生能力強的原球莖或根尖，應用植物有絲分裂染色體壓片技術制備標本。操作步驟如下:取根尖用飽和α-溴萘溶液4℃前處理24 h，固定液 (甲醇∶冰醋酸為3∶1)固定2 ～24 h，1 N HCl常溫下解離5 min，60℃水浴解離3 min，染色，壓片，鏡檢，拍照。對30個以上染色體分散良好的細胞進行染色體觀察和計數(shù)，取其平均值作為該植株體細胞染色體的數(shù)目，用這種方法分別確定出二倍體植株和四倍體植株體細胞的染色體的個數(shù)。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素處理對原球莖生長和分化的影響

將秋水仙素處理過的原球莖在培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 d后，轉接到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計其受害率和分化率 (圖1)。

從圖1可見，B4，C1，C4受害率明顯高與對照，均達到了20%，其分化率在52.0% ～57.5%，也顯著低于對照 (92.0%)。在相同浸泡時間處理時，秋水仙素濃度越高，其分化率越低。而采用相同濃度處理時，原球莖基本上隨著浸泡時間的增加其分化率在逐步下降。這說明秋水仙素對原球莖生長和分化有抑制作用。

圖1 秋水仙素處理對原球莖生長和分化的影響

2.2 秋水仙素處理的誘變效應

將處理后的原球莖接種到繼代培養(yǎng)基上，部分原球莖增殖分化，新形成的部分明顯比對照大，其分化出的植株粗壯，莖部明顯變粗，這些植株可能是多倍體 (圖2)。

圖2 秋水仙素處理后再生植株表型及染色體變異

在處理后原球莖分化的植株中，還發(fā)現(xiàn)多葉、葉片變寬變厚、顏色加深、呈墨綠色、矮化等類型統(tǒng)計變異植株占取材植株的百分率 (表1)。

與對照相比，秋水仙素濃度處理除 A1外，其余的再生植株部分發(fā)生變異，不同濃度處理產生的植株變異百分率大小依次為 B3＞B2＞C2＞A3＞B1＞A4＞ B4＞A2＞C4＞C3＞C1，即秋水仙素濃度為0.10%，誘導率相對其他濃度要高;相同濃度不同時間處理時，當濃度為0.10%時，處理3 d的變異率最大為19%，且再生植株四倍體加倍率為處理3 d時間最高，達4% ～5%。崔廣榮等［4］認為在相同時間的條件下，秋水仙素濃度越高，多倍體的誘變頻率越高;反之亦然，在相同秋水仙素濃度處理條件下，處理時間越長，多倍體誘變頻率也越高。

表1 秋水仙素處理后再生植株變異率

3 小結和討論

以蘭花原球莖和根狀莖為材料進行多倍體誘導在國內外已有一些研究報道。但不同研究者由于采用的材料不同，處理方法不同，所得到的研究結果也不盡相同。Dolezel等［2］用秋水仙素對蘭屬雜種的原球莖進行處理，發(fā)現(xiàn)秋水仙素濃度、處理時間和多倍體誘導率之間不是簡單的相關關系，用1 mg·mL-1秋水仙素處理7 d獲得的四倍體最多;Hsien 等［2］用 125 mg·L-1秋水仙素處理 Dortis pulcherrima的原球莖，當原球莖直徑為1.0～1.2 mm時，原球莖再生率為42% ～59%，再生植株中46%為四倍體;Kim等［4］用0.01%和0.05%秋水仙素處理寒蘭根狀莖，處理1周根狀莖的存活率分別為82.3%和57.2%，在再生植株中0.01%處理2周、0.05%和0.10%處理1周的多倍體

(2n=66～80)誘導率分別為4.5%，5.2%，6.7%;李雪嬌等［5］以野生碧玉蘭試管苗為材料，0.04%的秋水仙素處理72 h效果最好，誘導變異率達60%，死亡率為30%。本試驗結果表明，經秋水仙素處理的春蘭根狀莖分化率明顯低于對照，再生植株的變異誘導率與秋水仙素濃度和處理時間無明顯的簡單相關關系，變異試管苗形態(tài)上表現(xiàn)為葉片變寬、葉色加深、葉面粗糙、植株矮壯，且生長緩慢。當秋水仙素濃度為0.10%、處理3 d時，誘導率最高為19%，同時四倍體加倍率處理3 d最大，但與秋水仙素的濃度處理差異不大，原因有待于進一步研究。

［1］ 崔廣榮，張子學，張從宇，等.文心蘭多倍體誘導及其鑒定 ［J］.草業(yè)學報，2010(1):184-190.

［2］ Dozel J， Novak F J， CihalikovaJ， etal. Induction of tetraploid cymbidium plants from colchicines-treated protocorms Cultured in vitro ［J］. Plant Tissue Cell Culture，1984，455-456.

［3］ Hsien R M，Chen W H，Wu C C，et al.Artificial Induction of polyploidy in Doritis Pulcherrima［J］.Report of the Taiwan Sugar Research Institute，1991，132:13-18.

［4］ Kim Miseon， WonJeYang， SongChangHoon， etal.Polyploidy induction of Cymbidium Kanran by treatment of colchicine in vitro ［J］.Journal of Horticulture Science，1997，39(1):73-76.

［5］ 李雪嬌，李枝林，黃麗萍.野生碧玉蘭多倍體誘導及鑒定［J］.中國農學通報，2010，26(13):261-266.