RP-HPLC 法測定硝酸毛果蕓香堿滴眼液的有關物質(zhì)*

吳 燕，米亞嫻

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

毛果蕓香堿(pilocarpine)是由A 佩蒂特等于1879年從拉丁美洲產(chǎn)的毛果蕓香葉中提取的一種生物堿，它屬于擬膽堿藥，主要作用于毒蕈堿樣M 受體。硝酸毛果蕓香堿滴眼液局部用于青光眼的治療，在臨床上應用廣泛。該品種收載于《中國藥典》2010 年版二部，標準中未制定有關物質(zhì)檢查項，經(jīng)參考《英國藥典》2010 年版［1］硝酸毛果蕓香堿滴眼液的有關物質(zhì)檢查方法，建立了高效液相色譜主成分自身對照法，用于硝酸毛果蕓香堿滴眼液中有關物質(zhì)的測定，進一步完善了現(xiàn)行質(zhì)量標準。

1 儀器與試藥

島津2010C 高效液相色譜儀，PDA 檢測器。硝酸毛果蕓香堿滴眼液(國內(nèi)某企業(yè));硝酸毛果蕓香堿對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號100157 -200201，純度100%);磷酸二氫四丁基銨(進口試劑)、磷酸二氫銨、四丁基氫氧化銨均為分析純，甲醇為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充劑，甲醇-含0.002 mol/L 磷酸二氫銨和0.001 8 mol/L 四丁基氫氧化銨的水溶液(30∶ 70)為流動相，變流速梯度洗脫(0 →20 min，0. 8 ml/min;20. 1 →39 min，1. 6 ml/min;39.1→44 min，0.8 ml/min)，檢測波長為220 nm，進樣量20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取本品，加水制成每1 ml中約含硝酸毛果蕓香堿1.0 mg 的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 自身對照溶液制備 精密量取供試品溶液4 ml，置100 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為自身對照溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的制備 稱取硝酸毛果蕓香堿對照品約8.0 mg，溶于10 ml 0.002 5 mol/L 氫氧化鈉溶液中，水浴加熱30 min 后放冷，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，同時也作為毛果蕓香酸定位溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方制備不含硝酸毛果蕓香堿和抑菌劑的陰性樣品，并按供試品溶液的制法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取系統(tǒng)適用性溶液，進樣20 μl，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下硝酸毛果蕓香堿、異毛果蕓香堿和毛果蕓香酸的分離度均大于1.5，陰性對照在主成分和雜質(zhì)相應的保留時間處無干擾。典型分離圖見圖1。

圖1 供試品溶液(A)系統(tǒng)適用性溶液(B)陰性對照溶液(C)異毛果蕓香堿定位溶液(D)HPLC 色譜圖

2.4 線性考查 精密稱定硝酸毛果蕓香堿對照品適量，加水溶解并稀釋制成系列濃度的溶液。分別精密量取上述溶液20 μl 注入液相色譜儀，記錄色譜圖;以濃度為橫坐標，相對應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸。結(jié)果表明硝酸毛果蕓香堿在0.510 ～153.1 μg/ml濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好線性關系，回歸方程為A=26 688 C-7 220.8(r=1.000 0)。

2.5 檢出限試驗 取硝酸毛果蕓香堿對照品，用水稀釋制成不同濃度的溶液，在選定色譜條件下，按信噪比為3 對最低檢測量進行測定。結(jié)果表明，硝酸毛果蕓香堿最低檢出濃度0.2 μg/ml，檢出限為4 ng。

2.6 溶液的穩(wěn)定性 取供試品溶液分別于0、2、4、6和8 h 進樣，考查溶液室溫放置穩(wěn)定性。結(jié)果表明，硝酸毛果蕓香堿滴眼液有關物質(zhì)檢查供試液在8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 有關物質(zhì)測定 取本品2 批，分別按“2.2”項下的方法制備供試品溶液和自身對照溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果見表1。

表1 硝酸毛果蕓香堿滴眼液有關物質(zhì)測定結(jié)果

3 討論

3.1 硝酸毛果蕓香堿滴眼液收載于《中國藥典》2010年版二部，未規(guī)定有關物質(zhì)檢查項;而英國藥典2010年版硝酸毛果蕓香堿滴眼液有關物質(zhì)檢查方法中HPLC 系統(tǒng)流動相使用的“磷酸二氫四丁基銨”試劑國內(nèi)較難買到，且價格昂貴，試驗中參考有關文獻［2］，采用國產(chǎn)試劑“磷酸二氫銨”和“四丁基氫氧化銨”予以替代，經(jīng)比較，兩系統(tǒng)測定結(jié)果無明顯差異，見表2。

表2 2#樣品有關物質(zhì)測定結(jié)果比較

3.2 滴眼液中通常加入抑菌劑來抑制細菌生長，從而防止眼用制劑在使用和保存過程中被淚液及環(huán)境中的微生物污染［3］。試驗中發(fā)現(xiàn)，如僅采用等度洗脫方式將分析時間記錄到主峰保留時間的2 倍(約20 min)，則在多次進樣后會有異常峰出現(xiàn)。該峰經(jīng)定性為抑菌劑峰，其在等度條件下(150 mm 短柱，0. 8 ml/min流速)出峰時間較長，故采用變流速梯度洗脫方法，既縮短了分析時間，又可將樣品中的組分充分洗脫，同時可用于監(jiān)測滴眼液中抑菌劑的含量變化。

3.3 硝酸毛果蕓香堿滴眼液在臨床上廣泛用于青光眼的治療，屬于國家基本藥物目錄。有關物質(zhì)檢測方法的建立，完善了該產(chǎn)品的質(zhì)量標準，有利于更好地監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，保障人民用藥安全。

1 英國藥典.2010:3008

2 肖仰，尚素琴.硝酸毛果蕓香堿滴眼液的高效液相色譜分析及其穩(wěn)定性考察.中國醫(yī)院藥學雜志，1999，19(2):91

3 安彥. 眼用制劑中抑菌劑的應用與質(zhì)量控制. 天津藥學，2011，23(1):56