南瓜葉中γ-氨基丁酸的提取及薄層掃描測(cè)定

黃美娥，彭 勝，陳陽(yáng)波，袁洪昆

1吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2吉首大學(xué)城鄉(xiāng)資源與規(guī)劃學(xué)院，張家界427000

南瓜(Cucurbita moschata Duch.)系葫蘆科南瓜屬一年生蔓生草本植物，種植歷史悠久，世界各地均有栽培［1］。南瓜性味甘溫，入脾胃二經(jīng)，具有補(bǔ)中益氣、消炎止痛、解毒殺蟲(chóng)等功效。對(duì)其功能成分如γ-氨基丁酸、葫蘆巴堿等的研究報(bào)道很多［2］。南瓜葉作為保健食品資源之一，資源豐富，天然無(wú)公害，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于從南瓜葉中提取γ-氨基丁酸的研究鮮有報(bào)道。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡(jiǎn)稱GABA)，是一種重要的功能性非蛋白質(zhì)氨基酸，參與體內(nèi)的多種代謝活動(dòng)，具有很高的生理活性。GABA在醫(yī)藥、食品、飼料中具有廣闊的應(yīng)用前景，2009年9月 29日，GABA已被中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為可用于食品生產(chǎn)加工的新資源，開(kāi)發(fā)GABA產(chǎn)品及其功能性食品、保健品是當(dāng)前食品及醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一［3］。因此利用南瓜葉提取GABA，對(duì)充分利用南瓜資源具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)南瓜葉中GABA的提取測(cè)定進(jìn)行研究，旨在為南瓜葉的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法［4-7］

1.1 材料、試劑與儀器

南瓜葉:于7月采集吉首大學(xué)張家界校區(qū)后山菜園鮮南瓜葉，置恒溫干燥箱中50℃干燥至恒重，粉碎過(guò)40目篩，保存，備用。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品檢定研究所，純度≥99%;薄層層析硅膠G、茚三酮、正丁醇、冰醋酸、無(wú)水乙醇等均為分析純。

日本島津CS-9000型薄層掃描儀、RE-540旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、WT-150粉碎機(jī)、CS101-3D電熱鼓風(fēng)干燥箱、DSY-2-4孔電熱恒溫水浴鍋(北京國(guó)華醫(yī)療器械廠)、AEG-200十萬(wàn)分之一天平。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取γ-氨基丁酸對(duì)照品25 mg置于25 mL容量瓶中，用20%乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取南瓜葉樣品粉末10.00 g，加入20%的乙醇溶液100 mL，浸提1 h，過(guò)濾，定容至100 mL，搖勻，制得南瓜葉供試品溶液，備用。

1.2.3 薄層色譜條件與薄層掃描條件［3］

稱取硅膠G 30 g放入研缽中，加入0.5%CMCNa和60 mL水調(diào)成糊狀后涂布于玻璃板(10 cm× 20 cm)上，厚度為0.5 mm，置室溫風(fēng)干后于105℃活化1 h，置干燥器中備用。分別吸取5 uL的對(duì)照品溶液和供試品溶液點(diǎn)樣，用正丁醇、醋酸、水按4∶1∶1的比例配成展開(kāi)劑，飽和后按上行方式展開(kāi)。用0.2%茚三酮乙醇溶液噴霧顯色，105℃烘數(shù)分鐘，直至獲最大斑點(diǎn)，薄層掃描，根據(jù)薄層掃描結(jié)果確定南瓜葉中γ-氨基丁酸的薄層掃描條件為:反射式雙波長(zhǎng)線式掃描，λs=515 nm，λr=680 nm，狹縫為1.0*10.0 mm，SX=1。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取γ-氨基丁酸對(duì)照品100 mg用蒸餾水定容至100 mL，得1 mg/mL的γ-氨基丁酸對(duì)照品溶液。分別吸取1 mg/mL的γ-氨基丁酸對(duì)照品溶液，配成0.125、0.25、0.50、1.00、2.00 mg/mL的系列對(duì)照溶液。于硅膠板上點(diǎn)樣，層析展開(kāi)、顯色、薄層掃描，以對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，峰面積積為縱坐標(biāo)(y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=77747x+ 4948.7，相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。表明γ-氨基丁酸薄層掃描時(shí)濃度在0.125～2.0 mg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取對(duì)照品溶液5 μL點(diǎn)于薄層板上，按上述條件展開(kāi)、顯色、薄層掃描，每隔30 min掃描1次，共測(cè)定5次，計(jì)算峰面積的RSD(n=5)為5.34%，RSD(n=4)為2.50%，表明顯色后在2 h內(nèi)較穩(wěn)定。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

用毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取同一南瓜葉供試品溶液5 μL點(diǎn)樣，按上述條件展開(kāi)、顯色、薄層掃描，重復(fù)掃描6次，結(jié)果RSD為0.98%。

1.2.7 精密度實(shí)驗(yàn)

同板精密度試驗(yàn):用毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取對(duì)照品溶液5 μL點(diǎn)樣(重復(fù)點(diǎn)6個(gè)點(diǎn))，按上述條件展開(kāi)、顯色、薄層掃描，結(jié)果RSD為1.99%。異板精密度試驗(yàn):用毛細(xì)點(diǎn)樣管吸取對(duì)照品溶液5 μL點(diǎn)于6塊薄層板上，按上述條件展開(kāi)、顯色、依次掃描測(cè)定，結(jié)果RSD為2.13%。

1.2.8 加樣回收試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液5 μL，供試品溶液6 μL和對(duì)照品溶液5 μL，與供試品溶液3 μL的混合液分別點(diǎn)于同一薄層板上，按上述條件展開(kāi)、顯色、掃描，測(cè)得平均回收率(n=4)為99.61%，RSD(n=4)為2.04%。

1.2.9 提取條件的確定

1.2.9.1 提取溶劑的選擇

稱取10.00 g南瓜葉粉末10份于三角瓶中，分別加入蒸餾水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇各100 mL，于常溫浸提1 h，過(guò)濾，濾渣重提1次，合并濾液;分別進(jìn)行減壓濃縮、醇沉、過(guò)濾、濃縮，掃描測(cè)定。

1.2.9.2 提取時(shí)間的選擇

稱取10.00 g南瓜葉粉末10份于三角瓶中，加入20%乙醇100 mL，于常溫下分別浸提1、2、3、4、5 h，過(guò)濾，濾渣重提1次，合并濾液;減壓濃縮、醇沉、過(guò)濾、濃縮，掃描測(cè)定。

1.2.9.3 提取料液比的選擇

稱取10.00 g南瓜葉樣品10份于三角瓶中，分別加入20%乙醇80、100、120、140、160 mL，于常溫下浸提1 h，過(guò)濾，濾渣重提1次，合并濾液;減壓濃縮、醇沉、過(guò)濾、濃縮，掃描測(cè)定。

1.2.10 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)確定的范圍，選擇乙醇濃度、固液比、提取時(shí)間三因素作為考察對(duì)象，每因素確定三個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，因表水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素表Table 1 Orthogonal experiment facts

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)確定

2.1.1 提取溶劑的選擇結(jié)果

按1.2.9.1進(jìn)行提取測(cè)定，提取溶劑對(duì)南瓜葉中γ-氨基丁酸提取效果的影響結(jié)果為:以水和高濃度乙醇為提取溶劑比稀乙醇的提取效果差，以20%乙醇為提取溶劑進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)得γ-氨基丁酸含量值最高為156 mg/100 g，故選擇提取溶劑濃度的優(yōu)化區(qū)為10%～30%。

2.1.2 提取時(shí)間的確定

按1.2.9.2進(jìn)行提取測(cè)定，提取時(shí)間對(duì)南瓜葉中γ-氨基丁酸提取效果的影響結(jié)果為:隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取得到的γ-氨基丁酸的含量反而逐漸降低，提取時(shí)間為1 h進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)得γ-氨基丁酸含量值最高為148 mg/100 g，故選擇提取時(shí)間的優(yōu)化區(qū)為0.5 h～1.5 h。

2.1.3 固液比的選擇

按1.2.9.3進(jìn)行提取測(cè)定，提取料液比對(duì)南瓜葉中γ-氨基丁酸提取效果的影響結(jié)果為:隨料液比的增大，南瓜葉中γ-氨基丁酸的含量不斷提高，但料液比為1∶14～16時(shí)，增大料液比，含量增加放緩。所以，選擇料液比的優(yōu)化區(qū)為1∶15～17。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表(n=3)Table 2 The effects of orthogonal experiment(n=3)

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis

對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果由表3可見(jiàn)，因素B顯著，因素A和C不顯著，因素作用的主次順序是B＞A＞C，即浸提時(shí)間＞溶劑濃度＞料液比，與極差分析得出的結(jié)果一致。對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出南瓜葉中γ-氨基丁酸提取條件最優(yōu)水平組合為A2B2C3，即以20%乙醇為溶劑、浸提1 h、料液比1∶17，其γ-氨基丁酸的含量為209 mg/100 g。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按上述最佳條件A2B2C3進(jìn)行3次驗(yàn)證提取試驗(yàn)，測(cè)得南瓜葉中γ-氨基丁酸的含量分別為210、205、212 mg/100 g，平均含量209 mg/100 g。

3 結(jié)論

本研究采用單因素和正交試驗(yàn)確定了南瓜葉中γ-氨基丁酸的提取條件，即精密稱取供試品適量，加入17倍體積的20%乙醇、常溫浸提1 h。并以薄層掃描法測(cè)定南瓜葉中γ-氨基丁酸的含量為209 mg/ 100 g，其方法操作簡(jiǎn)單、靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 Jiangsu New Medical College(江蘇新醫(yī)學(xué)院編).Dictionary of Chinese Materia Mediaca(中藥大詞典(上冊(cè))).Shanghai:Shanghai Scientific＆Technical Publishers，1985.1555-1560，3225.

2 Liu Y(劉洋)，Zhang YW(張耀偉)，Cui CS(崔崇士).Correlative analysis on nutritional components and fruit characteistics of India pumpkin raised for pulp.Northern Horticul (北方園藝)，2007，(1):14-16.

3 Wei ZZ(魏珍珍)，Zhao M(趙明)，Li SR(李雙容)，et al.Study on feasibility of determination of GABA content in tea by colorimetric method.Acta Agric Jiangxi(江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào))，2010，22(8):56-58.

4 Huang ME(黃美娥)，Yu HZ(于華忠)，Cao Y(曹庸).Extraction and determination of γ-aminobutyric acid in fern.A-mino Acids＆Biotic Resour(氨基酸與生物資源)，2004，27:77-78.

5 Deng K(鄧康)，Luo J(羅健).TLC scanning determination of 4 kinds of neurotransmitter in mouse brain.Northwest Pharm J(西北藥學(xué)雜志)，2000，15:150-151.

6 Zhao CQ(趙長(zhǎng)琦)，Li GM(李廣民)，Wang J(王軍).TLC-densitometric determination of hypotensive constituent γ-aminobutyric acid in Hongqi.J Northwest Univ，Nat Sci(西北大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，1995，6:277-278.

7 Pang MJ(逄敏潔)，Li DW(李多偉)，Wang YC(王義潮)，et al.TLC scanning determination of sclareol.Chin J Pharm Anal(藥物分析雜志)，2008，28:1554-1555.