具殺螺活性的商陸根際真菌Aspergillus fumigatus SL-30發酵條件優化

郭丹釗，陳 鈞，杜向萍，張春曉，潘 靜

1江蘇大學食品與生物工程學院;2江蘇大學藥學院，鎮江212013

湖北釘螺(Oncomelania hupensis)是日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的唯一中間宿主［1］，因此殺滅釘螺是控制血吸蟲病流行的重要措施［2］。我國主要采用化學滅螺方法，如五氯酚鈉、氯硝柳胺等，化學藥物滅螺效果雖好，但都不同程度地存在選擇性較弱、持久性差、易造成環境污染等問題［3］。為彌補化學殺螺劑的不足，研究和開發更為安全有效的生物殺螺方法和生物殺螺劑對于控制血吸蟲病的傳播和保護生態環境，具有重要意義［4，5］。

本實驗室自藥用植物商陸的根際分離到一株真菌菌株Aspergillus fumigatus SL-30，其胞外發酵液具有顯著的殺螺活性，且對非靶生物毒性小，具有良好的開發利用價值［6］。在前期的工作基礎上，本研究采用Plackett-Burman(PB)設計法對影響菌株SL-30殺螺活性的主要因素進行篩選，并采用Box-Behnken中心組合設計進行響應面分析，研究了可溶性淀粉，蛋白胨和初始pH三個顯著因子的最佳水平，為菌株SL-30及其發酵液中殺螺活性物質的進一步研究和開發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:Aspergillus fumigatus SL-30，本實驗室分離自商陸根際。

釘螺(Oncomelania hupensis):采集自鎮江京口區長江村江灘，去氯水清洗后適應性培養1～2 d，剔除死螺，挑選6-7旋的健康成年釘螺進行殺螺活性測定。

氯硝柳胺(含量98%)，江蘇省血吸蟲病防治研究所惠贈;其余試劑均為國產分析純。

1.2 試驗設計

1.2.1 Plackett-Burman試驗

根據菌株SL-30生長所需要的營養要素的基本原則和發酵影響因素的一般規律，結合前期試驗，選用試驗次數N=12的Plackett-Burman試驗設計，對可溶性淀粉用量(X1)、蛋白胨用量(X2)、磷酸二氫鉀用量(X3)、硫酸鎂用量(X4)、接種量(X5)、裝液量(X6)、初始pH值(X7)、培養溫度(X8)8個因素作為影響因素進行全面考察，每個因素取兩個水平，響應值為殺螺率Y(%)，試驗設計和各因素水平編碼見表1和表2。運用Design-Expert 7.0.0軟件對各因素效應進行t檢驗，選擇置信度95%以上的因素作為重要因素進行后續響應面試驗。

1.2.2 響應面試驗設計(Response surface methodology，RSM)

響應面分析法是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法［7］。在PB試驗的基礎上，將得到的三個主要影響因子可溶性淀粉用量(A)、蛋白胨用量(B)和初始pH(C)進一步采用Box-Behnken中心組合設計進行響應面分析，每個因子取低、中、高三個水平:初始pH為1、3、5，可溶性淀粉含量為10、15、20 g/L，蛋白胨含量為2.5、3.75、5 g/L，響應值為殺螺率Y(%)。數據進行二次回歸擬合，得到帶交互項和平方項的二次方程，通過對回歸方程的方差分析，可以評價每個因子及其交互作用對響應值的影響程度。并用響應面圖和等高圖直觀的描繪結果，同時求出響應值最大時各因子的水平。

1.2.3 殺螺率測定

將發酵液過濾得發酵濾液，并稀釋至1.6%，采用WHO推薦的浸殺法測定濾液的殺螺活性，并統計各組殺螺率。

1.2.4 模型驗證

將優化試驗所得的數據與響應面模型進行擬合，確定其極值點以及取得極值時相應的自變量取值，進行六批次驗證試驗及可靠性分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman結果分析

根據試驗設計進行發酵試驗，結果列于表1，經Design-Expert 7.0.0分析和整理，各因素的效應分析結果見表2，可溶性淀粉用量(X1)，蛋白胨用量(X2)和初始pH(X7)作為重要因子的可信度大于95%，對菌株SL-30發酵濾液的殺螺活性影響顯著，并以此作為主要因素進行后續的響應面優化試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 1 Experimental design and result of Plackett-Burman

表2 各因素影響及重要性評價Table 2 Levels and effects of variables

2.2 Box-Behnken響應面優化結果

2.2.1 回歸模型的建立

對影響發酵濾液殺螺活性的三個關鍵因素可溶性淀粉，蛋白胨和初始pH值進行優化試驗，分別以可溶性淀粉15 g/L，蛋白胨3.75 g/L和初始pH 3為中心點實施響應面試驗，發酵濾液殺螺率為響應值，結果列于表3。

表3 Box-Behnken試驗設計與結果Table 3 Process variables and levels in response surface Box-Behnken design and reponse value

運用Design-Expert 7.0.0軟件對表3中試驗數據進行多元回歸擬合，得到響應面二次多元回歸模型:

對該方程式進行方差分析，結果列于表4。回歸模型的F值為12.31，其P=0.0065＜0.01，說明該模型高度顯著，失擬項的P=0.0732＞0.05，表明失擬項對于絕對誤差不顯著，殘差由隨機誤差引起，回歸模型無失擬因素存在，回歸模型有效［8］。精密度(Adeq precision)是有效信號與噪音的比值，大于4.0視為合理，本試驗精密度達到10.406，因此精密度較好;方程模型的相關系數R2=0.9568，表明該方程模型可解釋95.68%的發酵濾液殺螺活性變化，因此該模型可用于菌株SL-30發酵濾液的殺螺活性分析與預測。

由表4還可以看到，因素A和B對發酵濾液殺螺活性的線性效應顯著(其P值均小于0.05)，C不顯著，AB的交互影響顯著，而AC和BC不顯著，二次項效應均顯著，表明可溶性淀粉、蛋白胨和初始pH對發酵濾液殺螺活性的影響不是簡單的線性關系。

表4 回歸模型方差分析Table 4 ANOVA of quadratic polynomial model

168.04 0.44 0.5363 AB 1 5459.73 35.35 0.0019 AC 1 44.42 0.29 0.6147 BC 1 15.13 0.098 0.7669 A2 1 1449.67 9.39 0.0280 B2 1 2867.35 18.56 0.0077 C2 1 893.52 43.37 0.0012殘差項 5 154.45失擬項 3 255.49 8.91 0.0732純誤差 2 2.89 R2=0.9568 Adj R2=0.8791 C 1 Adeq Precision=10.406

2.2.2 響應面分析

三維響應面圖是回歸方程的圖形表表述，反應出各因素的交互作用，每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量保持在零水平［9］，通過響應面圖可以直觀、高效地找到最佳參數和各參數之間的相互作用及最大相應值;等高線圖的形狀表示交互作用的強弱，形狀為圓形交互作用弱，橢圓形則表示交互作用強［10］。在回歸模型方差分析結果的基礎上，利用軟件作可溶性淀粉、蛋白胨和初始pH對發酵濾液殺螺活性影響的響應面和等高線圖(圖1、2和3)。由此，可對任何兩個因素的交互作用進行分析與評價［11］。

圖1 可溶性淀粉與蛋白胨用量對殺螺活性交互作用的響應面與等高線圖Fig.1 Response surface plot and contour plot for the cross action of soluble starch content and peptone content on molluscicidal activity

圖1顯示，當初始pH為3時，可溶性淀粉與蛋白胨含量對發酵濾液殺螺率的交互影響。由圖可以看出，當可溶性淀粉的用量固定，蛋白胨的用量必須在一定的范圍內才可使發酵濾液的殺螺活性達到最大，也就是說，碳氮比要有一個合適的范圍，若超出該范圍則會降低發酵濾液的殺螺活性，說明過高或過低的碳氮比不利于菌絲的生長繁殖，進而影響殺螺活性成分在發酵液中的合成和積累。

圖2 可溶性淀粉用量與初始pH對殺螺活性交互作用的響應面與等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot for the cross action of soluble starch content and initial pH on molluscicidal activity

蛋白胨用量為3.75 g/L條件下，初始pH和可溶性淀粉用量對發酵濾液殺螺活性的影響如圖2所示。由圖可以看到，當可溶性淀粉用量為12.5 g/L左右時，隨著初始pH的逐漸增大，發酵濾液的殺螺率呈現先升高后降低的過程，當初始pH調整為2左右時，隨著可溶性淀粉用量的增加也呈現相同的變化，這表明初始pH和可溶性淀粉用量過高或過低都不利于菌絲的生長和殺螺活性成分的合成。可溶性淀粉在12.5～20 g/L范圍內，初始pH控制在2～4，發酵濾液可呈現最大的殺螺活性。

圖3顯示當可溶性淀粉用量為15 g/L時，蛋白胨含量與初始pH對發酵濾液殺螺率的交互影響。由圖可以看到，當蛋白胨用量大約為2.66 g/L左右時，隨著初始pH的逐漸增大，發酵濾液的殺螺率先升高后降低，當初始pH調整為2左右時，隨著蛋白胨用量的增加也呈現相同的變化，這表明初始pH和蛋白胨用量過高或過低都不利于菌絲的生長和殺螺活性成分的合成。可溶性淀粉在2.66～4.38 g/L范圍內，初始pH控制在2～4，發酵濾液的殺螺活性最強。

圖3 蛋白胨用量與初始pH對殺螺活性交互作用的響應面與等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot for the cross action of peptone content and initial pH on molluscicidal activity

以發酵濾液殺螺活性最高為優化目標，以可溶性淀粉用量、蛋白胨用量和初始pH為優化對象，利用Design-Expert7.0.0軟件對上述模型進行了優化處理，確定最優發酵條件為可溶性淀粉16.40 g/L，蛋白胨3.76 g/L，初始pH 3(為方便操作，將軟件計算得到的pH 3.05在操作中改為pH 3)，該模型理論預測的最大響應值為98.949%。

2.3 模型驗證

結合以上的優化條件，其他影響不顯著的因子取中間值，得到菌株SL-30的發酵培養條件為:可溶性淀粉16.40 g/L，蛋白胨3.76 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.25 g/L，接種量0.5%，裝液量50 ml/250 ml，初始pH 3，培養溫度28℃。

為檢驗模型預測的可靠性，利用以上優化培養條件分6批次進行發酵，每批三個重復，測定發酵濾液的殺螺活性均在98%左右(表5)，接近預測值，6批次之間相對標準偏差為1.96%，二者的良好擬合性證實了模型的有效性。因此，基于響應面法所得的菌株SL-30發酵條件參數準確可靠，具有實用價值。

3 討論

植物根際有益微生物是土壤微生物的一部分，它們可在根際定殖并代謝產生種類豐富的次級代謝物［12］，其中存在具有抑菌殺蟲等生物活性的成分［13-15］，具有進一步研究開發的價值。從生態學角度來看，設法將可產生殺螺活性物質的微生物定殖于植物根際環境，構建微生物-植物生態滅螺抑螺系統，可長效控制釘螺的繁殖和危害，在一定程度上緩解化學滅螺藥物帶來的弊端。

分離自商陸根際的真菌菌株SL-30，其發酵液具有顯著的殺螺活性，對光照穩定，且對非靶生物毒性低，具有較好的開發前景。其發酵液中的殺螺活性物質有待進一步分離和鑒定，以及菌株在植物根際的定殖也有待進一步研究和探索。

表5 優化發酵條件的驗證Table 5 Verification of optimum fermentation conditions

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