紅曲菌轉化子性狀分析及分子驗證*

蔡琪敏， 莊靜娜， 魏銀文， 吳寒華，崔宇輝， 曹麗凌， 蔣冬花

(浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004)

紅曲菌在我國已經有上千年的應用歷史，是我國寶貴的科學文化遺產［1］．現代研究表明，紅曲具有降血脂、降血壓、抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲勞等多重功效［2］．紅曲菌能產生 Monacolins類、γ-氨基丁酸(GABA)、麥角固醇、色素、淀粉酶等多種生理活性物質［3］，在食品、釀酒、制醋、中藥等方面都有著廣泛的用途［4］．從醫學角度看，紅曲菌中含有許多值得研究的基因．但迄今為止，對紅曲菌的研究主要集中在菌種分類與選育、發酵條件研究、桔霉素檢測等方面，關于其分子生物學方面的研究才剛剛起步，只在紅曲菌分類、DNA文庫構建、遺傳轉化體系建立、Monacolin K和桔霉素代謝調控途徑相關基因的研究等方面取得了一定的進展［5-9］，對紅曲菌的遺傳背景知識了解很少，對紅曲菌的形態分化、發育及次生代謝相關基因信息的報道也很少．

本實驗以根癌農桿菌介導的紅曲菌突變體庫中538株轉化子菌株為材料，通過菌落形態觀察并結合顯微特征分析，篩選轉化子，進行分子驗證和穩定性檢測，并檢測了紅曲菌中的主要代謝產物紅曲色素和γ-氨基丁酸(GABA)，以期為今后研究紅曲菌代謝產物的合成調控機理奠定基礎．

1 材料與方法

1．1 實驗材料

出發菌株：紫色紅曲菌(Monascus purpureus)S菌株，由本實驗室篩選并保藏;

突變菌株：538株轉化子菌株來自本實驗室構建的紅曲菌T-DNA插入突變庫，由本實驗室保藏．

1．2 突變體庫的構建

采用實驗室建立的根癌農桿菌介導紅曲菌的高效轉化體系構建突變體庫：紅曲菌在PDA培養基上培養21 d后收集孢子，制備紅曲菌孢子懸浮液，孢子濃度為106個/mL，根癌農桿菌溶液的A600為0．5，誘導劑乙酰丁香酮(AS)的濃度為100 μmol/L，農桿菌與紅曲菌在25℃共培養3 d．

1．3 轉化子的篩選

將轉化子活化后轉接到PDA培養基上，30℃培養7～14 d，與出發菌株S比較，根據菌落形態、大小、顏色和生長速度等特征，挑選變異明顯的轉化子，拍照，保存備用．

1．4 轉化子遺傳穩定性的分析

將隨機挑選的20株紅曲菌轉化子用無菌牙簽挑取菌絲接種到不含潮霉素的PDA培養基上，30℃培養7 d．連續轉接6次后，再轉接到含潮霉素的PDA培養基上，同時接種出發菌株S作為對照，30℃培養，觀察轉化子的生長情況和菌落形態，并計算其穩定性．計算公式為：轉化子穩定性

1．5 轉化子的PCR鑒定

1．5．1 轉化子基因組DNA的提取

將轉化子菌株接種于PDA培養基上活化，按2%的接種量接入裝有40 mL PDA培養基的250 mL錐形瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養3 d．過濾收集菌絲體，洗滌，用濾紙及吸水紙盡量吸干水分．取適量菌絲樣品于研缽中，加液氮快速研磨成粉末．采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取基因組 DNA［10］．

1．5．2 聚合酶鏈式反應(PCR)

根據pATMT1上的潮霉素基因序列設計一對引物HygS1和HygA1，序列為：5'-ATGCCTGAACT CACCGCGAC-3'，5'-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3'，50 μL 體系中進行 PCR 擴增．PCR 程序為94℃ 3 min后進入循環：94℃ 20 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，共35個循環，然后72℃延伸10 min．電泳檢測，拍照記錄．

1．6 轉化子菌落與顯微形態的觀察

將活化后的轉化子接種到PDA培養基上，30℃培養7～14 d，觀察菌落形態特征．根據文獻［11］的方法對供試菌株進行觀察和描述．

用接種環挑取轉化子的菌絲，制成玻片，在顯微鏡下觀察轉化子的顯微特征．

1．7 轉化子紅曲色素的分析

將轉化子菌株接種于PDA培養基上活化，按2%接種量接入培養基中，30℃，200 r/min振蕩培養7 d．取培養液加95%乙醇溶液，4℃，8 000 r/min離心15 min，取上清液，稀釋，以相同處理(加95%乙醇溶液)的不接入紅曲菌的培養液為空白對照，測定300～600 nm波長下的吸光度，分析吸收峰值．色價(U/mL)=稀釋倍數×吸光度．

1．8 轉化子γ-氨基丁酸(GABA)產量的研究

將轉化子菌株接種于PDA培養基上活化，按2%接種量接入培養基中，30℃，200 r/min振蕩培養48 h．采用改良紙色譜法［12］，測定520 nm處的吸光度，與標準曲線對比，計算 γ-氨基丁酸(GABA)的產量．

2 結果與分析

2．1 突變體庫的構建

采用實驗室建立的根癌農桿菌介導紅曲菌的高效轉化體系構建突變體庫，共獲得538株轉化子．

2．2 轉化子的遺傳穩定性

將538株轉化子接種到PDA培養基上，隨機挑選20株突變株進行穩定性研究．結果顯示，連續轉接6次后，對照菌株不能生長，而20株轉化子菌株均能在含有100 μg/mL潮霉素的PDA培養基上正常生長，其遺傳穩定性高達100%，比文獻［8］中的高，表明潮霉素抗性基因已經整合到紅曲菌基因組中并能穩定遺傳．

2．3 轉化子的PCR鑒定

如果根癌農桿菌Ti質粒中的T-DNA成功轉移到紫色紅曲菌基因組DNA中，1 106 bp就能擴增出潮霉素基因特征條帶，據此可以鑒定T-DNA是否成功插入到紅曲菌基因組中．

隨機選取9株具有代表性的轉化子菌株進行PCR鑒定，并與出發菌株S比較，結果見圖1．這9株供試菌株在1 000 bp左右均有條帶，且條帶清晰、無雜帶，說明T-DNA已經插入到紫色紅曲菌基因組DNA中．

圖1 紅曲菌轉化子的PCR鑒定

2．4 轉化子的形態

2．4．1 菌落形態

將538株轉化子接種到PDA培養基上，30℃培養7 d，比較轉化子菌株與出發菌株S在菌落形態、顏色等方面的差異．結果表明，大部分轉化子與出發菌株差別不大，只有少數轉化子發生了較大變化．選取有代表性的9株轉化子菌株與出發菌株一起觀察，其菌落特征見表1和圖2．

2．4．2 顯微形態

將9株轉化子菌株與出發菌株S在PDA培養基上培養7 d，挑取菌絲制成玻片，在顯微鏡下觀察形態特征．結果如圖3所示：出發菌株S的菌絲呈透明膠管狀，隔膜清晰，分生孢子與子囊孢子均較多;轉化子S25的菌絲透明且細小，隔膜不明顯，孢子很少;轉化子S18，S29和S30的菌絲中色素顆粒均較多，呈現紅色，不透明，但S29的孢子很少，S30的隔膜清晰，S18與S29的隔膜不清晰;轉化子S32和S36的菌絲纖細透明，分生孢子較多，但S36的菌絲形狀不規則，旁枝很多;轉化子S34的菌絲干凈透明，隔膜明顯;轉化子S41和S55的菌絲中內容物均較多，前者菌絲中多為色素顆粒，后者菌絲中其他內容物居多，且前者的菌絲變異較多．

表1 9株代表性轉化子菌株的菌落形態

2．5 轉化子紅曲色素的變化

圖3 9株代表性菌株的顯微形態結構

將紅曲菌菌株的乙醇浸提液適當稀釋后，于300～600 nm波長下測定吸光度，每個轉化子菌株設置3個重復．由表2可見，紅曲菌轉化子的紅曲色素不僅色價發生了變化，而且吸收波長也發生了不同程度的變化．如：出發菌株S的吸收峰Ⅰ和吸收峰Ⅱ分別為415和495;而色價明顯下降的S18的吸收峰Ⅰ變為390，吸收峰Ⅱ沒變．原因可能是轉化子的色素代謝途徑發生了某些變化，使色素的組成發生了改變，這對色素相關基因的研究有重要意義．

2．6 轉化子γ-氨基丁酸(GABA)產量的變化

轉化子菌株與出發菌株中GABA含量的紙色譜見圖4．圖4顯色明顯，拖尾現象與背景干擾等情況較少．由圖4可以清楚地看出轉化子菌株在GABA含量上的差異，在同樣是5 μL上樣量的情況下，轉化子菌株 S18，S25，S30，S32，S36，S41和S55的GABA含量與出發菌株S相比有明顯的升高，S18和S32更是達到1 g/L以上．

表2 9株代表性轉化子紅曲色素的變化

圖4 9株代表性轉化子培養液中GABA的紙色譜分析結果

9株轉化子與出發菌株S的GABA含量的分析結果見表3．

表3 9株代表性轉化子培養液中GABA含量的變化

3 討論

T-DNA插入到紅曲菌基因組之后，會影響某些基因的表達，從而引起突變，這些變化將會表現在各個方面，形態突變是比較直觀的方面，而菌落形態等的直觀變化又常常和其他的重要改變，如次級代謝產物的變化相關聯［13］．

本實驗研究發現，與出發菌株相比，轉化子菌落形態發生的變異主要表現在以下幾個方面：菌落大小、菌落顏色、氣生菌絲形態、菌體產孢子能力、菌落發生隆起突變、出現輻射紋或裂紋等．

微生物的次級代謝是指在一定的生長時期(通常在后期)，以初級代謝物質為前體，合成一些對微生物的生命活動無明確功能的物質的過程．次級代謝產物的合成與相關酶催化的代謝途徑有關，它們多數是菌株所特有的性質［14］．紅曲菌在生長過程中能產生多種次級代謝產物．盡管有學者對紅曲菌部分代謝產物做了研究，如法國的Hajjaj等的研究表明紅曲菌產桔霉素與紅曲色素的代謝途徑的起點相同［15］，但是紅曲菌的各種次級代謝過程及代謝途徑尚不清楚．

本實驗從538株轉化子中挑選了9株代表性菌株，主要對9株轉化子菌株與出發菌株的紅曲色素與γ-氨基丁酸(GABA)的分泌能力進行了分析研究，結果表明轉化子不同代謝產物的分泌能力均發生了不同程度的變化，推測可能是T-DNA插入紅曲菌基因組阻斷了不同的調控途徑或代謝途徑所致．

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