己酮可可堿對肝硬化大鼠體內一氧化氮含量的影響

譚璐東 劉亞輝 王英超 (吉林大學白求恩第一醫院肝膽胰外科，吉林 長春 130021)

肝硬化是各種慢性肝臟疾病的并經階段，國內外研究證實由于肝硬化、門脈高壓導致腸道蠕動減慢、細菌大量繁殖、腸道屏障功能減低，細菌內毒素入血導致體內一氧化氮(NO)含量過量增加，最終使體內血管異常擴張。我們首先建立大鼠的肝硬化模型，測定血清中NO含量，發現其含量明顯增加，后給予己酮可可堿(PTX)口服，觀察兩組大鼠體內NO含量的改變。

1 材料與方法

1.1 動物 雌性Wistar大鼠，清潔級，體重200～220 g，購自吉林大學動物實驗中心。

1.2 膽總管結扎肝硬化動物模型的建立 雌性Wistar大鼠30只，禁食12 h禁水4 h。其中20只，10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉，仰臥于固定板上，剪去上腹部毛，沿腹正中線切開皮膚3 cm，打開腹腔，找到胃幽門部、十二指腸，在十二指腸降部找到白色有韌性的膽管，游離并在其下2根4-0絲線，靠近膽總管末端結扎，兩線間距約0.5 cm，中段離斷。其余10只為假手術組，僅打開腹腔并游離膽總管。各組動物分別于術后40 d行肝臟病理活檢。術后120 d對兩組動物采頸靜脈血測定血清NO含量，將手術組20只大鼠隨機分成兩組，一組給予PTX葡萄糖溶液口服，一組給予葡萄糖溶液口服。5 w后復查血清NO含量。

1.3 病理學觀察 常規石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

1.4 NO測定 應用南京建成生物工程研究所生產的一氧化氮試劑盒檢測血清中NO含量。

2 結果

2.1 一般情況 實驗中實驗組大鼠死亡2只，死亡原因考慮:麻醉藥物劑量過大;術后出現急性膽管炎或肝衰竭。其余18只大鼠正常存活。對照組大鼠未見死亡。

2.2 肝臟病理學改變 術后40 d剖腹取肝臟活檢，術中可見結扎的膽總管明顯增粗，1 ml注射器穿刺抽出黃綠色膽汁。術后病理證實:與正常對照組比較，病理組織學可見彌漫增生的膽小管，大量炎癥細胞在膽小管周圍，肝細胞周圍結締組織增生假小葉形成。20只大鼠除2只死亡外，其余18只肝臟纖維化改變。見圖1。

2.3 血清NO含量 對照組大鼠共10只，生存良好，術后120 d血清NO含量(36.3±9.8)μmol/L，實驗組大鼠共存活18只，術后120 d血清NO含量(164.7±15.9)μmol/L，兩者差異有統計學意義(t=26.40，P＜0.05)。將實驗組大鼠隨機分成兩組，一組給予PTX葡萄糖注射液口服，一組給予葡萄糖注射液口服。5 w后取靜脈血，給予 PTX組大鼠血清 NO含量(134.1±9.5)μmol/L，給予葡萄糖組大鼠血清 NO含量(181.2±14.9)μmol/L，兩者差異有統計學意義(t=8.00，P＜0.05)。

圖1 肝硬化病理學改變

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病的最終階段，我國是一個肝炎大國，以肝炎后肝硬化最為常見，因此加強對肝硬化的基礎和臨床研究是十分必要的。目前尚無十分理想的肝硬化模型，國內多采用化學藥物、微生物、病毒等手段誘導大鼠肝硬化〔1〕，我院普外科于1998年采用硫代乙酰胺誘導大鼠肝硬化模型，但上述方法除安全性差外。我們參考國外文獻〔2，3〕，采取膽總管雙重結扎法建立肝硬化模型，術后病理證實肝臟假小葉形成，國外學者已對上述模型從血清生化學、病理學方面給予證實〔4〕。與以往建模方法相比，該法具有以下優點:①模型穩定，膽管結扎并切斷避免了膽道再通，持續的膽汁淤積可以使肝臟病理改變持續發展;②操作簡便，無需反復給藥;③安全性高，試驗人員及周圍動物不需接觸病毒或化學藥物;④實驗花費少。因此，大鼠膽總管阻塞建立的肝硬化模型可用于肝硬化的研究及治療。

NO是細胞間信息傳遞的重要調節因子，作為第二信使和神經遞質有著許多不同的功能，并參與許多生理、病理過程，參與信息傳遞、介導炎癥反應并引起血管的擴張〔5〕。生物體內的NO是由底物+L-精氨酸-氧化氮合酶催化生成，人體內已知的三種NOS分別為神經型NOS、內皮型NOS、誘導型NOS，其中前兩種在人體內發揮生理作用，而后者在體內一般不表達，但在內毒素的誘導下可以大量表達〔6〕。肝硬化患者一方面腸黏膜充血水腫、腸道蠕動減慢，腸內細菌過度繁殖，產生大量內毒素;另一方面腸黏膜屏障功能減低以及門體靜脈分流，細菌及內毒素入血，刺激機體產生TNF-α等炎性介質，直接或通過誘導肝細胞本身表達NO。近來研究表明，NO作為一種遞質，參與了肝硬化門脈高壓癥高動力循環狀態的形成和維持，并在其中起重要作用。誘導型NOS誘導產生大量的NO，引起外周血管明顯擴張，降低外周阻力，增加心排血量，即為高動力循環。同時NO又擴張脾靜脈及腸系膜上靜脈，導致門靜脈血流量增加，加重了門脈高壓癥〔7〕。

PTX是非特異磷酸二酯酶抑制劑，抑制細胞磷酸二酯酶，減少CAMP水解為5'-磷酸腺苷，使胞內CAMP升高，抑制Ca2+內流，防止肌動蛋白收縮，有效降低血管通透性。另有研究表明，PTX可以減少粒細胞氧自由基的生成，減少細胞凋亡。還可以減少eNOS和iNOS的產生，減少NO的合成。PTX可以減少成纖維細胞增殖，有證據表明肝硬化是由于肝內成纖維細胞增殖所致，因此該藥物亦可以用于肝硬化的患者〔8〕。

1 George J，Rao K，Stern R.Dimethyl-nitrosamine-induced liver injury in rats:the early deposition of collagen〔J〕.Toxicology，2001;156(2-3):129-38.

2 Nan JX，Park EJ，Lee SH，et al.Antifibrotic effect of Stephania tetrandra on experimental liver fibrosis induced by bile duct ligation and scission in rats〔J〕.Arch Pharm Res，2000;23(5):501-6.

3 Suchuppan D，Strobel D，Hann EG.Hepatic fibrosis therapeutic strategies〔J〕.Digestion，1998;59:385.

4 Abdel-Aziz G，Lebeau G，Rescan PY，et al.Reversibility of hepatic fibrosis in experimental induced cholestasis in rat〔J〕.Am Assoc Pathol，1990;137(6):1333.

5 秦士勇，聶培蘭，張曙光，等.肝硬化門脈高壓癥患者肝組織中一氧化氮含量和一氧化氮合酶活性的變化〔J〕.中華消化雜志，2006;26(2):130-1.

6 Ivakiri Y.The molecules:mechanisms of arterial vasodilatation observed in the splanchnic and systemic circulation in portal hypertension〔J〕.J Clin Gastroenterol，2007;41(13):288-94.

7 Thomsen LL，Miles DW.Role of nitric oxide in tumour progression:lessons from human tumours〔J〕.Cancer Metastasis Rev，1998;17:107-18.

8 張詞俠，張桂林.己酮可可堿的藥理特性和治療用途的研究進展〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2008;24(1):74-7.