TGF-β1在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及意義

趙長祺 于海龍 楊坤寶 趙耀紅 路國兵 (承德醫學院基礎醫學部，河北 承德 067000)

甲狀腺癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，其中甲狀腺乳頭狀癌(PTC)約占甲狀腺癌的60% ～70%〔1〕。國內外研究表明，甲狀腺癌是多因素作用的結果，其發生的具體機制尚未完全揭示。轉化生長因子(TGF)是一種多功能的細胞因子，其中TGF-β1在調節甲狀腺癌的發生、發展及預后中起到了重要作用，對腫瘤的生長有促進作用〔2〕。本文采用免疫組化法和Western印跡檢測TGF-β1在甲狀腺癌組織及正常組織中的表達，探討二者在甲狀腺癌治療上的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床標本 2009年9月至2010年8月承德醫學院附屬醫院的甲狀腺乳頭狀癌組織標本60例，癌周組織20例，年齡45～65歲，其中男21例，女39例。患者臨床資料完整，術前均未接受化療和放療，均為經典根治術，經病理檢查證實均為原發甲狀腺乳頭狀癌。所有臨床病理標本經10%甲醛溶液固定，常規脫水透明、浸蠟、包埋，連續切片，切片厚4 μm，用于TGF-β1免疫組織化學染色;臨床病理標本新鮮組織用于蛋白印記雜交檢測。

1.2 主要試劑 兔抗TGF-β1多克隆抗體(美國Sigma公司);羊抗兔IgG二抗(美國Rockland公司);免疫組化試劑盒(美國Invitrogen公司)。

1.3 TGF-β1蛋白免疫組化染色 石蠟切片常規脫蠟至水，微波修復抗原室溫孵育20 min，以消化內源性過氧化物酶，10%正常羊血清封閉30 min，分別加一抗TGF-β1，濕盒中孵育，4℃過夜，滴加二抗，Envision試劑室溫孵育1 h。各步驟間均以0.01 mol/L PBS緩沖溶液沖洗5 min連續3次。顯微鏡下控制顯色時間，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察、照相。用PBS緩沖溶液代替一抗作為陰性對照，以甲狀腺乳頭狀癌癌周組織作對照組。細胞質和部分細胞核著棕色顆粒者為TGF-β1陽性，不著色者為陰性。

1.4 TGF-β1蛋白印記雜交檢測 提取組織總蛋白，BCA法進行蛋白濃度定量，應用蛋白印記雜交法對甲狀腺癌及癌周組織TGF-β1的蛋白水平進行檢測。一抗選用兔抗TGF-β1多克隆抗體，二抗選用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，β-actin作為內參，應用Western印跡方法檢測甲狀腺癌及癌周組織TGF-β1蛋白的表達水平。蛋白上樣量40 μg，10%SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，抗體孵育(一抗終濃度2 μg/ml)，采用化學發光法顯色，暗室X光膠片曝光，采用Alpha Innotech軟件分析照片中蛋白條帶的灰度值，并計算各待測條帶與其相應內參β-actin的灰度值比值。

1.5 統計學處理 采用SPSS12.0統計軟件，組間差異顯著性用方差分析法檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 TGF-β1在甲狀腺癌組織中的表達 TGF-β1陽性染色呈棕黃色細顆粒狀，前者主要表達于胞質內，細胞核也有表達，后者主要表達在甲狀腺癌周圍間質的血管內皮細胞。TGF-β1甲狀腺乳頭狀癌組織中的陽性表達(70.26%±12.39%)明顯高于癌周組織(33.27% ±6.98%)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 甲狀腺乳頭狀癌TGF-β1表達，胞質內可見棕黃色的陽性顆粒(×200)

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織中TGF-β1的相關性 對甲狀腺乳頭狀癌及癌周組織TGF-β1蛋白的Western印跡檢測結果，見圖2。TGF-β1蛋白分子量為25 kD，與空白對照組相比，甲狀腺乳頭狀癌組織中TGF-β1蛋白的表達明顯升高。以各待測條帶與其相應內參β-actin的灰度值比值做統計學分析，結果表明，與空白癌周組織TGF-β1(0.32±0.04)相比，甲狀腺癌組織TGF-β1蛋白的表達(0.71±0.13)顯著上調。見圖2。

圖2 甲狀腺乳頭狀癌中TGF-β1的表達

3 討論

TGF-β1為25 kD的二聚體多肽，主要在內皮細胞、血細胞、結締組織細胞和上皮細胞中表達。目前認為，TGF-β1促進腫瘤發生機制并非直接促進腫瘤細胞增殖，而是腫瘤細胞對TGF-β1誘導的抑制信號失去敏感性，以及TGF-β1抑制免疫反應，促進腫瘤基質生成等多種生物學作用的結果，是調節細胞增殖和分化的多功能細胞因子〔3〕。TGF-β1還可促使血管生成，刺激血管平滑肌細胞增生和分化，使血管樣結構成為穩定的、成熟的血管床，導致腫瘤轉移〔4〕。本研究表明，TGF-β1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達顯著高于癌周組織。提示，TGF-β1與甲狀腺腫瘤的發展和轉移有關，且其在蛋白水平上具有促進腫瘤血管生成、侵襲的能力。

綜上，甲狀腺乳頭狀癌TGF-β1的表達與甲狀腺乳頭狀癌的發展及轉移相關，TGF-β1表達逐漸增強，是甲狀腺乳頭狀癌病情進展和腫瘤轉移的重要信號。TGF-β1表達越高，腫瘤轉移性越強，預后越差。提示甲狀腺乳頭狀癌中TGF-β1表達水平可作為判斷臨床療效和預后的指標。

1 Singh N，Rogers P，Atwood CW，et al.Short-course empiric antibiotic therapy for patients with pulmonary infiltrates in the intensive cane unit〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2000;162(2):505-11.

2 Tovng PL，Chan WY.Decreased expression of human papillo mavirus E2 protein and transforming growth factor-beta l in human cervical neoplasia as nearly marker in carcinogenesis〔J〕.J Surg Oncol，2003;84(1):17-23.

3 Shariat SF，Kim JH，Andrews B，et al.Preoperative plasma levels of transforming growth factor beta 1 strongly predict clinical outcome in patients with bladder carcinoma〔J〕.Cancer，2001;92(12):2985-92.

4 丁國芳，徐銀峰，楊最素，等.TGF-β1在前列腺癌中的表達及其與生存率關系的研究〔J〕.浙江醫學，2006;28(9):709-11.