乙酰肝素酶和血管內(nèi)皮生長因子C mRNA的表達(dá)與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)

蘇樹偉 田 輝 李 林 岳韋名 高 存 司立博 (山東省交通醫(yī)院胸外科，山東 濟(jì)南 25003)

肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌病人死亡的主要因素。乙酰肝素酶(HPSE)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-C mRNA的表達(dá)是否與肺癌的侵襲性生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究同時(shí)采用RT-PCR法檢測了65例肺癌組織、癌旁組織和正常肺組織中HPSE和VEGF-C mRNA的表達(dá)，以探討HPSE和VEGF-C mRNA的表達(dá)與肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 所有病例均來源于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院胸外科2006年9月至2007年7月間經(jīng)臨床病理確診的65例肺癌病人，患者術(shù)前均未行放、化療。其中男性51例，女性14例，年齡41～76歲，中位年齡61歲。病程1～12個(gè)月，平均3.6個(gè)月。鱗癌31例(47.7%)，腺癌25例(28.5%)，大細(xì)胞癌3例(4.6%)，小細(xì)胞癌6例(9.2%)。高分化癌17例(26.2%)，中分化癌23例(35.4%)，低分化癌16例(24.6%)，未分化癌9例(13.8%)。65例患者無住院期間死亡，術(shù)后隨訪至2002年12月;實(shí)訪61例，失訪4例，隨訪率93.8%。

1.2 標(biāo)本的采集和保存 全部標(biāo)本均在手術(shù)中收集，取材后速凍于液氮中，-80℃超低溫貯存?zhèn)溆谩Ｄ[瘤組織均在原發(fā)灶取材，避開壞死、炎癥區(qū)域;癌旁組織取自相應(yīng)腫瘤旁2 cm;非癌組織(遠(yuǎn)癌肺組織或正常肺組織)取自距腫瘤邊緣5 cm以上之肺組織，并經(jīng)病理學(xué)檢查未見癌細(xì)胞。

1.3 RT-PCR法檢測HPSE mRNA 以TRIzol試劑(Gibco公司)提取總RNA，具體操作按廠家推薦步驟進(jìn)行。提取后以紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad公司)測定其純度(A260/A280≥1.8)并定量，在1%甲醛變性凝膠上電泳驗(yàn)證RNA完整性。半定量RTPCR檢測HPSE mRNA表達(dá)，采用一步法試劑盒(Katara公司)中的廠家推薦步驟進(jìn)行，擴(kuò)增體積50 μl。以持家基因GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)量為內(nèi)參照，對樣品模板用量標(biāo)準(zhǔn)化。HPSE和GAPDH分兩管進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列參照文獻(xiàn)〔1〕設(shè)計(jì):HPSE上游引物:5'-TTCGATCCCAAGAAGAAGGAATCAAC-3'，下游引物:5'-GTAGTGATGCCATGTAACTGAATC-3';GAPDH上游引物:5'-TCCTGCACCACCAACTGCTT-3'，下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。RT-PCR條件參考文獻(xiàn)〔1〕并稍加優(yōu)化:50℃ 逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃變性 45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，28 個(gè)循環(huán);72℃充分延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以Fluor-S多功能成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)掃描并拍照。

1.4 RT-PCR法檢測 VEGF-C mRNA總RNA提取試劑，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，VEGF-C的 RT-PCR特異引物序列由Life Technologies公司合成，片段長度183 bp。上游引物:5'-TGTACAAGTGTCAGCTAAGG-3';下游引物:5'-CCACATCTATACACACCTCC-3'。β-actin 片段長度 268 bp，上游引物:5'-CAACTTCATCCACGTTGACC-3'，下游引物:5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3'。PCR 循環(huán)參數(shù):94℃，1 min;55℃，90 s;72℃，90 s。循環(huán) 30次，在72℃延伸10 min。以試劑盒提供之對照RNA樣品及其特異性引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性對照，以反應(yīng)系統(tǒng)中不加模板RNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對照，以β-actin為內(nèi)對照。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察，與Markers對比堿基對大小，以出現(xiàn)明顯與目的基因堿基相同的區(qū)帶為陽性〔2〕。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用方差分析及t檢驗(yàn)，多計(jì)量資料之間的關(guān)系比較用多元線性回歸分析，應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 HPSE和VEGF-C mRNA在正常肺組織、癌旁組織和肺癌組織中的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示，肺癌組織中HPSE和VEGFC mRNA陽性表達(dá)率(55.4%、61.5%)明顯高于癌旁組織和正常肺組織(12.3%、15.4%;3.1%、4.6%，P ＜0.05)，見圖1，圖2。

2.2 HPSE和VEGF-C mRNA表達(dá)與肺癌組織類型、分化程度、分期及預(yù)后 不同類型和不同分化程度肺癌組織中HPSE和VEGF-C mRNA的陽性表達(dá)率比較無顯著差異(P＜0.05);Ⅲ期和Ⅳ期肺癌組織中HPSE和VEGF-C mRNA陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期(P＜0.05);生存3年以下肺癌HPSE和VEGF-C mRNA陽性表達(dá)率明顯高于生存3年以上者(P＜0.05)，圖3、圖4和見表1。

圖1 ODC mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜(HPSE)

圖2 ODC mRNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜(VEGF-C)

圖3 HPSE基因mRNA表達(dá)

圖4 VEGF-C基因mRNA表達(dá)

表1 HPSE mRNA、VEGF-C mRNA陽性表達(dá)與肺癌組織類型、分化程度、分期及預(yù)后〔n(%)〕

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特征，也是影響腫瘤患者治愈率的主要因素。HPSE可在數(shù)個(gè)位點(diǎn)上降解硫酸乙酰肝素，破壞細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的完整性，從而有利于腫瘤細(xì)胞穿越細(xì)胞外基質(zhì)和血管壁，促進(jìn)其侵襲和轉(zhuǎn)移;同時(shí)還有利于血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和生長，促進(jìn)新生血管的形成〔3～5〕。VEGF-C是唯一可與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的VEGFR-3(Flt4)結(jié)合并特異性促進(jìn)淋巴管生長的因子，當(dāng)其與受體Flt-4結(jié)合后，可促進(jìn)腫瘤淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖〔6～9〕。本研究提示HPSE mRNA表達(dá)在肺癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移以及血管生成中發(fā)揮著作用，HPSE參與了肺癌組織的血管形成和肺癌細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。VEGF-C是促進(jìn)腫瘤經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移的重要因素，因此可以推測肺癌細(xì)胞分泌VEGF-C，可能通過激活支氣管壁淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的VEGFR-3引起腫瘤周圍淋巴管增生，或誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)淋巴管形成，從而使腫瘤細(xì)胞通過淋巴管進(jìn)行轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散;由此可見，肺癌的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移可能是HPSE促微血管生成和VEGF-C促淋巴管生成協(xié)同作用所致。

本研究結(jié)果提示HPSE和VEGF-C mRNA在促進(jìn)肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中可能具有普遍意義。HPSE和VEGF-C mRNA高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力強(qiáng)，HPSE和VEGF-C mRNA在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞穿越血管壁、實(shí)行擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用，結(jié)果提示HPSE和VEGF-C mRNA可作為判斷肺癌生物學(xué)行為和患者預(yù)后的一個(gè)參考指標(biāo)。

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