三種方法檢測Aβ所致PAJU細胞凋亡

丁斌蓉 涂秋云 楊 霞 白 松 劉 肖 唐湘祁 (中南大學湘雅三醫院老年科，湖南 長沙 4003)

研究表明Aβ神經毒性涉及介導氧化應激及炎癥反應、神經元內鈣超載、誘導細胞凋亡、改變突觸功能等多個方面〔1～5〕。其中，誘導細胞凋亡是Aβ神經毒性的一個重要環節。腦卒中和腦缺血后阿爾茨海默病(AD)的發生率顯著增加，缺氧是AD的病因之一〔6〕。故觀察缺氧條件下Aβ作用所致神經細胞凋亡的情況對探討AD的損傷機制和評估各種防治因素的效果具有重要意義，選擇一種合適的檢測細胞凋亡的方法對觀察效果起著決定性的作用。為選擇一種理想的檢測神經細胞凋亡的方法，我們對MTT法、Hoechst 33258細胞核染色法、流式細胞檢測這幾種常用的觀察細胞凋亡的方法進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人神經母細胞瘤細胞株(PAJU細胞由芬蘭赫爾辛基大學生命科學院 Carl G.Gahmberg教授惠贈);Aβ42(rPeptide公司);MTT、Hoechst 33258(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);低溫高速冷凍離心機(Eppendorf)，酶標儀 (SUNRISE，TECAN，Switch);流式細胞計數儀(FACScan，BECTON DICKINSON，USA);熒光顯微鏡 (BX60，OLYMPUS，Japan);Microtek ScanMaker 5600 掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”處理〔7，8〕以儲存濃度為231 μmol/L 置于37℃的PBS中孵育7 d左右即為“老化”狀態。

1.2.2 細胞培養 PAJU細胞以5×105/孔接種于6孔細胞培養板，37℃，培養穩定后，分組:①常態組:常態 PAJU細胞50 ml/L CO2培養箱培養96 h;②Aβ干預組:將PAJU細胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預，繼續培養96 h;③缺氧組:將PAJU細胞置于缺氧環境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培養箱)培養96 h;④Aβ干預+缺氧組:將PAJU細胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預，并置于缺氧環境中培養96 h。收取細胞樣品，分別用MTT法、Hoechst 33258細胞核染色、流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.3 MTT法觀察細胞 取對數生長期的上述各組PAJU細胞，于干預前1 d以5×104/孔接種于無菌的96孔板。置37℃、飽和濕度、5%CO2和95%空氣的培養箱中繼續培養24 h，然后再根據各組細胞的實驗要求進一步按上述方法處理和培養至96 h，棄去培養基，加入5 g/L MTT 20 μl后繼續培養4 h，最后加入150 μl DMSO，酶標儀測定各孔A490 nm吸光度值。計算細胞存活率。

1.2.4 Hoechst 33258細胞核染色 取對數生長期的PAJU細胞株，調整細胞密度至1×104/ml，接種于無菌24孔板中，每孔1 ml。置37℃、飽和濕度、5%CO2和95%空氣的培養箱中繼續培養24 h，再根據各組細胞的實驗要求進一步按上述方法處理和培養至96 h，并分別于24、48及96 h將四組細胞取出，4%多聚甲醛固定20 min，1 mg/ml的 Hoechst 33258避光染色10 min后封片、避光，熒光顯微鏡下觀察。觀察后照相并計數500個細胞核，計算凋亡核百分率。

1.2.5 細胞凋亡率的流式細胞檢測 取對數生長期的PAJU細胞株，調整細胞密度至1×106/ml，接種于無菌6孔板中，每孔3 ml。置37℃、飽和濕度、5%CO2和95%空氣的培養箱中繼續培養24 h，再根據各組細胞的實驗要求進一步按上述方法處理和培養至96 h，并分別于24、48及96 h將四組細胞取出，75%乙醇固定細胞，4℃保存。上機前加入PI，孵育10 min。

1.3 統計學處理 采用SPSS10.0統計軟件進行統計分析，各組數據均以s表示，用析因分析法進行統計分析，流式細胞學檢測中圖像分析系統所采集的數據進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 Hoechst 33258細胞核染色 見圖1。Hoechst 33258將細胞核染為紫藍色。正常細胞核呈均勻彌散熒光，凋亡細胞核呈濃染塊狀或顆粒狀熒光。對照組的PAJU細胞24、48和96 h后，細胞中核濃染、邊集及碎裂比例較少，經缺氧、Aβ42處理、缺氧+Aβ42共同處理24、48和96 h后，細胞中核濃染、邊集及碎裂比例較多。各組凋亡核百分率見表1。

圖1 Hoechst 33258細胞核染色PAJU細胞

表1 Hoechst 33258細胞核染色凋亡核百分率(s，n=3，%)

表1 Hoechst 33258細胞核染色凋亡核百分率(s，n=3，%)

24 h 48 h 96 h組別

2.2 MTT比色法顯示Aβ42、缺氧對細胞增殖的影響 對照組、缺氧組、Aβ干預組、缺氧+Aβ干預組的 PAJU細胞24、48和96 h后存活率見表2。對照組與缺氧組、對照組與Aβ42組，缺氧組或 Aβ42組與缺氧并 Aβ42處理組間差異有顯著意義(P＜0.05)。另外，對照組與缺氧并Aβ42處理組間比較具有極顯著差異(P＜0.01)。

表2 MTT比色法顯示Aβ42、缺氧對PAJU細胞增殖的影響( s，n=3，%)

表2 MTT比色法顯示Aβ42、缺氧對PAJU細胞增殖的影響( s，n=3，%)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與缺氧組、Aβ42組比較:3)P ＜0.05，下表同

0.98±0.11 0.94±0.15 0.92±0.23缺氧組 0.82±0.171) 0.67±0.241) 0.63±0.141)Aβ42組 0.78±0.131) 0.57±0.211) 0.37±0.141)Aβ42并缺氧組 0.65±0.112)3) 0.51±0.112)3) 0.31±0.102)3)24 h 48 h 96 h對照組組別

2.3 流式細胞儀檢測缺氧、Aβ42所致PAJU細胞凋亡率的影響流式細胞儀檢測凋亡細胞(亞G1期細胞)百分率，結果顯示PAJU對照組、缺氧處理組、Aβ42處理組、缺氧并Aβ42處理組24、48及96 h后，細胞凋亡率依次分別為(2.11%，3.79%，5.32%;8.23%，17.45%，24.21%;9.89%，19.15%，25.33%;14.12%，23.25%，45.10%)，組間兩兩比較，對照組與缺氧組、Aβ組比較，其凋亡率有顯著增加(P＜0.05);對照組與缺氧并Aβ42處理組比較，其凋亡率有極顯著增加(P＜0.01);缺氧組與Aβ組比較，其凋亡率無顯著變化(P＞0.05)。

3 討論

MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法，其特點是靈敏度高，重復性好，操作簡便，無放射性污染，與其他檢測細胞活力的方法有良好的相關性〔9〕。本實驗在預試驗的基礎上用MTT比色法檢測發現缺氧、Aβ42、Aβ42同時予以缺氧處理能不同程度地影響PAJU細胞的能量代謝，干擾PAJU細胞的增殖和存活，實驗細胞存活率下降呈時間依賴性。

Hoechst 33258染色液可直接用于固定細胞或組織的細胞核染色，也可直接用于活細胞或組織的細胞核染色。本研究發現，缺氧、Aβ42對神經細胞的毒性作用之一是破壞細胞核;此外，還發現，在Aβ42同時予以缺氧處理的PAJU細胞，細胞核損壞更為嚴重，其凋亡率明顯上升，說明缺氧環境可以加重Aβ42的神經毒性作用，這種效應呈時間依賴性。

流式細胞術是一種生物學技術，用于對懸浮于流體中的微小顆粒進行計數和分選。這種技術可以用來對流過光學或電子檢測器的一個個細胞進行連續的多種參數分析。流式細胞術可以檢測的參數有:細胞的體積和形態復雜程度DNA(細胞周期分析、細胞動力學、細胞增殖等)，細胞存活能力、細胞凋亡等。本實驗流式細胞儀檢測結果顯示，缺氧、Aβ42對PAJU細胞有抑制作用，缺氧能加重Aβ所致細胞凋亡，與文獻一致〔10〕。

通過比較上述MTT比色法、Hoechst 33258細胞核染色、流式細胞技術在本實驗中的應用，我們發現這三者對于細胞活性的檢測結果基本一致。凋亡的檢測方法有多種，不同的樣品可以用不同的方法來檢測。上述三種檢測方法各具特點，可相互補充:MTT比色法快捷、方便，適合懸浮及貼壁生長的細胞的活性檢測;Hoechst 33258細胞核染色對于細胞核受損的檢測比較敏感，實驗所需試劑較多，步驟較MTT法復雜;流式細胞技術更適合用于懸浮生長的細胞，對于貼壁生長的細胞，如果實驗前需要刮取細胞，可能破壞細胞完整性，而影響實驗結果。

1 Tickler AK，Wade JD，Separovic F.The role of Abeta peptides in Alzheimer's disease〔J〕.Protein Pept Lett，2005;12(6):513-9.

2 Tomiyama T，Matsuyama S，Iso H，et al.A mouse model of amyloid beta oligomers:their contribution to synaptic alteration，abnormal tau phosphorylation，glial activation，and neuronal loss in vivo〔J〕.J Neurosci，2010;30(14):4845-56.

3 Verdier Y，Zarandi M，Penke B.Amyloid beta-peptide interactions with neuronal and glial cell plasma membrane:binding sites and implications for Alzheimer's disease〔J〕.J Pept Sci，2004;10(5):229-48.

4 Agostinho P，Cunha RA，Oliveira C.Neuroinflammation，oxidative stress and the pathogenesis of Alzheimer's disease〔J〕.Curr Pharm Des，2010;16(25):2766-78.

5 Hjorth E，Frenkel D，Weiner H，et al.Effects of immunomodulatory substances on phagocytosis of abeta(1-42)by human microglia〔J〕.Int J Alzheimers Dis，2010:2010.

6 Sun X，He G，Qing H，et al.Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2006;103(49):18727-32.

7 Lopes JP，Oliveira CR，Agostinho P.Role of cyclin-dependent kinase 5 in the neurodegenerative process triggered by amyloid-Beta and prion peptides:implications for Alzheimer's disease and prion-related encephalopathies〔J〕.Cell Mol Neurobiol，2007;27(7):943-57.

8 邱小忠，余 磊，秦建強，等.β-淀粉樣蛋白(1-42)對PC12細胞的氧化損傷〔J〕.中國病理生理雜志，2006;22(2):2.

9 孫衛民，王慧琴.細胞因子研究方法學〔M〕.北京:人民衛生出版社，1999:65-7.

10 Egashira N，Iwasaki K，Ishibashi M，et al.Hypoxia enhances beta-amyloid-induced apoptosis in rat cultured hippocampal neurons〔J〕.Jpn J Pharmacol，2002;90(4):321-7.