缺血預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷神經細胞的保護作用

胡躍強 唐 農 董少龍 劉尊敬 祝美珍 胡玉英 王棕可

(廣西中醫學院第一附屬醫院神經內科，廣西 南寧 530023)

腦缺血預處理(BIP)是指對腦組織采用機械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導腦組織產生內源性保護機制，使其對以后較長時間的缺血性損傷產生顯著的耐受。這種現象又稱為腦缺血耐受(IT)。本實驗通過建立大鼠局灶性BIP模型，以觀察BIP對腦缺血再灌注損傷神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及處理 健康雄性SD大鼠60只，體重(250±50)g，隨機將大鼠分為三組:假手術組、大腦中動脈缺血再灌注組(MCAO)、假手術 +腦缺血組;BIP組:預缺血+腦缺血組(BIP+MCAO);每組按照再缺血后12 h、1、2、3 d四個時間點平均分為4個亞組(n=5)。分別作如下處理:假手術組:以假手術代替預缺血及缺血再灌注;MCAO組:以假手術代替預缺血，其余步驟同BIP組;BIP組:MCAO 10 min后抽出栓線，完成預缺血，3 d 后再次行 MCAO 2 h，再灌注后12 h、1、2、3 d 處死大鼠。

1.2 動物模型及標本制備 參照Longa的線栓法進行造模。采用大腦中動脈二次線栓法〔1〕制備大鼠腦缺血預處理模型，結扎大鼠左頸外動脈遠端和頸總動脈近端，將前端用火焰燒圓的尼龍線從頸總動脈殘端插入，進線約18～20 mm，MCAO后10 min抽出線栓，完成預缺血。3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后規定時間點心腔內抽取動脈血，凝固后立即以3 000 r/min離心15 min，取上血清-80℃保存備測，并同時處死動物取腦。

1.3 觀察指標 ①神經細胞凋亡率檢測:大鼠迅速斷頭取腦，分離缺血半暗帶腦組織100 mg，1.25 g/L胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，70%乙醇4℃過夜固定樣品，次日離心棄乙醇收集細胞，加入50 mg/L RNase，37℃孵育30 min，再加入50 mg/L碘化丙啶，4℃避光染色30 min，300目篩網過濾，利用美國貝克曼-庫爾特FC 500流式細胞儀計數10 000個細胞，測定各期細胞DNA含量并計算凋亡細胞所占比例。②血清NSE濃度測定:采用雙抗夾心ELISA法檢測大鼠血清中的NSE含量。按試劑盒說明進行操作。

2 結果

2.1 神經細胞凋亡率檢測結果 流式細胞術細胞周期定量分析表明，假手術組未見明顯的凋亡峰，其細胞凋亡百分率很低。腦缺血再灌注12 h后，MCAO組細胞凋亡發生率較假手術組顯著增加(P＜0.01)，1 d時達到高峰，以后時間點逐漸下降，但仍高于假手術組(P＜0.01);BIP組各個時間點神經元凋亡發生率較MCAO組顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)。說明BIP具有減輕腦缺血再灌注后神經元凋亡的作用。見表1。

2.2 血清NSE濃度測定結果 假手術組大鼠血清NSE含量很低;大鼠腦缺血再灌注后12 h血清中NSE的含量明顯升高(P＜0.01)，至缺血1 d達到高峰，以后時間點逐漸下降，但仍高于假手術組(P＜0.01);BIP組各個時間點血清 NSE較MCAO組顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表1 各組大鼠神經細胞凋亡率比較(s，%，n=5)

表1 各組大鼠神經細胞凋亡率比較(s，%，n=5)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與MCAO組同時間點比較:2)P＜0.05，3)P ＜0.01

12 h 24 h 2 d 3 d假手術組組別4.5±1.4 5.0±1.8 4.6±1.2 5.2±1.6 MCAO組 34.6±11.51)48.2±12.41)38.7±14.61) 29.2±9.31)BIP組 25.3±9.02) 36.4±10.93)30.8±11.22) 22.5±8.72)

表2 各組大鼠血清NSE比較( s，pg/ml，n=5)

表2 各組大鼠血清NSE比較( s，pg/ml，n=5)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與MCAO組同時間點比較:2)P＜0.05

12 h 24 h 2 d 3 d假手術組組別8.73±2.93 9.68±3.55 10.06±3.19 8.65±3.02 MCAO組19.06±6.541)30.45±9.801)25.90±7.661)18.83±5.751)BIP組 14.50±4.262)23.19±5.382)19.64±4.922)13.66±3.872)

3 討論

自1990年Kitagawa〔2〕發現缺血耐受以來，對腦缺血防治的認識開辟了新的領域，為腦保護提供了新的思路，這種通過激發機體的內源性保護機制，以增強對下一次嚴重損傷的抵抗能力的方法受到廣泛關注，目前被認為是最強的內源性保護機制。研究表明〔3〕:單次或多次累積時間20～30 min的短暫局灶缺血為最佳耐受誘導劑，可使缺血面積減少達30%，另有實驗表明:亞致死性缺血預處理的暴露時間與誘導耐受形成的間歇期，對再次長時間致死性缺血損害的耐受持續時間呈劑量反應曲線關系。缺血預處理耐受機制目前仍不十分清楚，研究表明耐受是涉及遞質、受體、通道、基因表達、蛋白質合成的多環節調控的復雜生物學過程。多數人認為它的一般機制為〔3，4〕:缺血預處理可引起組織釋放以腺苷為主的內源性遞質，并與相應的受體結合，通過激活信號傳導通路來啟動特定的基因，表達出具有保護作用的效應物，抑制神經細胞的壞死或凋亡，從而發揮對神經元的保護作用。Prasad等〔5〕研究表明，腦缺血預處理可通過激活PI3K-Akt途徑發揮抗神經細胞凋亡作用。Du等〔6〕研究發現MLK3信號途徑在大鼠腦缺血預處理細胞凋亡保護中發揮重要作用。

本研究采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，該方法較原位末端標記、DNA凝膠電泳、形態學觀察等方法具有定量精細且可避免壞死細胞干擾的優點。本研究提示BIP誘導了腦組織產生某種抗凋亡機制，抑制了再次缺血后神經細胞凋亡。

NSE是糖酵解過程中的一種關鍵酶，特異地存在于神經系統中，在大腦中含量最高，性質穩定。在缺血性腦損害神經元變性壞死后，NSE可釋放出來，透過血腦屏障進入血液中，因而血液中NSE水平可以反映腦損傷的程度。本實驗結果與文獻報道結果相一致〔7〕。

綜上，BIP可以抑制腦缺血損傷后細胞凋亡和壞死，進而起到保護神經元的作用，減輕隨后發生的更為嚴重的致死性缺血性腦損傷。這些有助于進一步了解BIP的作用機制，且對于尋找腦保護的有效途徑具有積極意義，其機制值得進一步研究。

1 郝玉曼，羅祖明，周 東.局灶預缺血誘導腦缺血耐受的動物模型〔J〕.中風與神經疾病雜志，2003;20(2):129-30.

2 Kitagawa K，Matsumoto M，Tagaya M，et al.“Ischemic tolerance”phenomenon found in the brain〔J〕.Brain Res，1990;528(1):21-4.

3 Zhao H，Sapolsky RM，Steinberg GK.Interrupting reperfusion as a stroke therapy:ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2006;26(9):1114-21.

4 Steiger HJ，Honggi D.Ischemic preconditioning of the brain，mechanisms and applications〔J〕.Acta Neurochir(Wien)，2007;149(1):1-10.

5 Prasad SS，Russell M，Nowakowska M.Neuroprotection induced in vitro by ischemic preconditioning and postconditioning:modulation of apoptosis and PI3K-Akt pathways〔J〕.J Mol Neurosci，2011;43(3):428-42.

6 Du Y，Li C，Hu WW，et al.Neuroprotection of preconditioning against ischemic brain injury in rat hippocampus through inhibition of the assembly of GluR6-PSD95-mixed lineage kinase 3 signaling module via nuclear and non-nuclear pathways〔J〕.J Neurosci，2009;161(2):370-80.

7 金麗英，劉真友，楊學偉，等.兔腦缺血再灌注后NSE和S-100的表達及其血清水平的變化〔J〕.中國康復醫學雜志，2007;22(11):964-7.